Ανάπτυξη βιοαισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για εφαρμογές υγρής βιοψίας
Ανάπτυξη βιοαισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για εφαρμογές υγρής βιοψίας
Date
2023-10-28
Authors
Σωτηρίου, Μάρκος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία επικεντρώνεται στην ανάπτυξη βιοαισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων με εφαρμογές σε δείγματα υγρής βιοψίας που αποτελούν ένα εναλλακτικό διαγνωστικό εργαλείο που ξεχωρίζει για την απλότητα, το χαμηλό κόστος παραγωγής, την ταχεία ανάλυση και την ευκολία στη χρήση. Η εργασία χωρίζεται σε δύο μέρη. Στο πρώτο μέρος, αναπτύχθηκε ένα γρήγορο, πολυαναλυτικό τεστ για την γονοτύπιση του γονιδίου KRAS σε εξωσωμικό DNA από δείγματα πλάσματος υγειών ατόμων και ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Στο δεύτερο μέρος, μελετήθηκε ένας διαφορετικός τρόπος απομόνωσης μορίων microRNA (miRNA), συγκεκριμένα των miR-21 και miR-let-7a, από δείγματα ούρων με μία τεχνική ‘ψαρέματος’ χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου ή μαγνητικά σφαιρίδια και την ανίχνευσή τους σε ένα βιοαισθητήρα DNA. Οι δύο προτεινόμενοι βιοαισθητήρες στηρίζονται στην χρήση έγχρωμων νανοσωματιδίων χρυσού για οπτική ανίχνευση των αποτελεσμάτων με γυμνό οφθαλμό.
Αρχικά, μελετήθηκε η ανίχνευση του φυσιολογικού αλληλόμορφου και τριών μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών του κωδικονίου 12 του γονιδίου KRAS σε DNA από εξωσώματα πλάσματος αίματος που έχουν συσχετιστεί με το καρκίνο του παχέος εντέρου (colorectal cancer, CRC). Για την ανάπτυξη του τεστ, δοκιμάστηκε η ανίχνευση των μεταλλάξεων σε συνθετικά μόρια DNA που φέρανε τις εκάστοτε μεταλλάξεις. Τα μόρια-στόχοι υποβλήθηκαν σε αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) με τη χρήση εκκινητών που έφεραν αλληλουχίες αναγνώρισης για κάθε μετάλλαξη και πραγματοποιήθηκε ανίχνευσή τους με τον προτεινόμενο βιοαισθητήρα, κατόπιν θερμικής αποδιάταξης των προϊόντων. Στη διαγνωστική μεμβράνη του βιοαισθητήρα ήταν ακινητοποιημένα μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου που είχαν συζευχθεί με αλληλουχίες συμπληρωματικές ως προς τις αλληλουχίες αναγνώρισης των προϊόντων PEXT. Επιπλέον, το τεστ δοκιμάστηκε σε δείγματα DNA από κυτταρικές σειρές και ιστούς ασθενών με CRC που έφεραν κάποιες από τις μεταλλάξεις που μελετήθηκαν. Τα δείγματα DNA ενισχύθηκαν με αντίδραση PCR, υποβλήθηκαν σε αντίδραση PEXT και αναλύθηκαν στο πολλαπλό βιοαισθητήρα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν μελέτες για την απομόνωση των εξωσωμάτων από δείγματα ασθενών, καθώς και για την απομόνωση του DNA από το εσωτερικού τους. Το προτεινόμενο πρωτόκολλο εφαρμόστηκε στα δείγματα εξωσωμικού DNA, τα οποία αναλύθηκαν με τον πολλαπλό βιοαισθητήρα και δώσανε τα επιθυμητά αποτελέσματα.
Στο δεύτερο μέρος της εργασίας, μελετήθηκε ένα εναλλακτικό πρωτόκολλο απομόνωσης miRNAs από δείγματα ούρων. Πιο συγκεκριμένα, η προτεινόμενη μεθοδολογία στηρίζεται στην απομόνωση των miRNAs από τα δείγματα ούρων με τη χρήση μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου και μαγνητικών σφαιριδίων, τα οποία είχαν συζευχθεί με ειδικές αλληλουχίες συμπληρωματικές ως προς τα miR-21 και miR-let-7a, που έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζονται στο καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Τα miRNAs προσδένονται λόγω συμπληρωματικότητας στις αλληλουχίες των τροποποιημένων σφαιριδίων και αποδεσμεύονται κατόπιν διεργασίας με NaOH. Τα απομονωμένα μόρια υποβλήθηκαν σε αντίστροφη μεταγραφή, αντίδραση PCR, υβριδοποίηση με ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές και εφαρμόστηκαν στο προτεινόμενο βιοαισθητήρα DNA. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές απομόνωσης σε δείγματα συνθετικών ούρων, ώστε να βελτιστοποιηθεί το πρωτόκολλο απομόνωσης και στη συνέχεια δοκιμάστηκε σε δείγματα ούρων. Για τον έλεγχο των αποτελεσμάτων του εναλλακτικού πρωτόκολλο απομόνωσης κατασκευάστηκε καμπύλη βαθμονόμησης, καθώς επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανάλυσης δειγμάτων με διαφορετικές συγκεντρώσεις miRNAs και σύγκριση με PCR πραγματικού χρόνου, που δώσανε τα προσδοκόμενα αποτελέσματα.
Description
Keywords
Βιοαισθητήρας, Νανοσωματίδια χρυσού, Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός, Γονίδιο KRAS, Υγρή βιοψία, Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων