Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/10716
Title: Ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων
Other Titles: Detection of specific nucleic acid sequences
Authors: Χριστοπούλου, Σπυριδούλα
Keywords: Αλλεργιογόνα τροφίμων
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR
Χημειοφωταύγεια
Βιοφωταύγεια
Φρεάτια μικροτιτλοδότησης
Κυτταρομετρία ροής
Επεξεργασμένα τρόφιμα
Ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής
Σύζευγμα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης
Βιοτινυλιωμένο προϊόν PCR
Μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου
Φθορίζουσες χρωστικές
Σύζευγμα στρεπταβιδίνης-φυκοερυθρίνης
Keywords (translated): Food allergens
DNA
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Gel electrophoresis
Chemiluminescence
Bioluminescence
Microtiter wells
Solid substrates
Flow cytometry
Probe
Processed foods
Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate
B-PCR product
Polystyrene microspheres
Fluorescent dyes
Streptavidin-phykoerythrin conjugat
Abstract: Οι τροφικές αλλεργίες ορίζονται σαν μια απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος στις πρωτεΐνες των τροφίμων. Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Ένωση, η ύπαρξη αλλεργιογόνων στα τρόφιμα πρέπει να αναγράφεται στη συσκευασία. Η βιομηχανία τροφίμων έχει ορίσει ανώτερα όρια της ποσότητας των αλλεργιογόνων που επιτρέπεται να υπάρχει στα τρόφιμα, είτε αυτά έχουν προστεθεί κατά την παραγωγή, είτε λόγω διασταυρούμενης επιμόλυνσης. Για το λόγο αυτό υπάρχει ανάγκη για την ανάπτυξη αναλυτικών τεχνικών για την ανίχνευση αλλεργιογόνων ουσιών στα επεξεργασμένα τρόφιμα. Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται είτε στις πρωτεΐνες των τροφίμων είτε στο γονιδιακό τους υλικό. Το DNA είναι προτιμότερος αναλύτης, επειδή παρουσιάζει μεγαλύτερη ανθεκτικότητα ιδιαίτερα κατά την επεξεργασία των τροφίμων. Στην εργασία αυτή θα παρουσιαστεί η ανάπτυξη δύο μεθόδων, που βασίζονται στο DNA, για την ανίχνευση διαφόρων ξηρών καρπών. Πιο συγκεριμένα, παρουσιάζεται η ανάπτυξη μιας χημειοφωταυγειομετρικής και μιας φθορισμομετρικής μεθόδου για την ανίχνευση διαφόρων ξηρών καρπών. Οι μέθοδοι εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA των ξηρών καρπών φιστικιού, φουντουκιού και καρυδιού, τόσο σε ωμούς ξηρούς καρπούς, όσο και σε επεξεργασμένα τρόφιμα. Στο κεφάλαιο 1, παρουσιάζονται τα διάφορα αλλεργιογόνα και ειδικότερα των τροφίμων, καθώς και οι μέθοδοι ανίχνευσής τους. Παρουσιάζονται οι γενικές αρχές των μεθόδων αυτών οι οποίες μπορεί να βασίζονται είτε σε πρωτεΐνες είτε στο DNA, καθώς και οι βασικές αρχές μιας άλλης μεθόδου ανίχνευσης, της κυτταρομετρίας ροής. Στο κεφάλαιο αυτό, περιγράφεται η αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), ως η πιο σημαντική τεχνική εκθετικού πολλαπλασιασμού ειδικών αλληλουχιών DNA, η οποία αποτελεί αναπόσπαστο μέρος κάθε σύγχρονης μεθόδου ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Τέλος, επισημαίνεται και η μέθοδος προσδιορισμού των προϊόντων της PCR. Το 2ο κεφάλαιο, περιλαμβάνει την έννοια της χημειοφωταύγειας. Αναφέρονται επίσης, οι βασικότερες χημειοφωταυγειομετρικές και βιοφωταυγείς αντιδράσεις που πραγματοποιούνται με τη χρήση κατάλληλων υποστρωμάτων. Αντικείμενο του κεφαλαίου 3, είναι η ανίχνευση των νουκλεϊκών οξέων μέσω δοκιμασιών υβριδοποίησης, σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης. Παρουσιάζονται τα διάφορα στερεά υποστρώματα με τα οποία μπορεί να είναι κατασκευασμένα τα φρεάτια αυτά. Γίνεται αναφορά επίσης στα διάφορα συστήματα τα οποία χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση. Στο κεφάλαιο 4 παρέχεται σύντομη περιγραφή της αρχής λειτουργίας και της οργανολογίας της κυτταρομετρίας ροής, η οποία αποτελεί ένα ισχυρό αναλυτικό εργαλείο για τη διερεύνηση ιδιοτήτων μικροσωματιδίων (π.χ. κυττάρων αλλά και συνθετικών μικροσφαιριδίων). Στο κεφάλαιο 5 παρουσιάζεται η διαδικασία απομόνωσης γενωμικού υλικού από τους ξηρούς καρπούς, καθώς και από επεξεργασμένα τρόφιμα, όπως μπισκότα, τα οποία παρασκευάστηκαν και περιείχαν και τους τρείς ξηρούς καρπούς σε ποσοστά από 0,01-5%. Στη συνέχεια, ειδικές αλληλουχίες του DNA των ξηρών καρπών ενισχύονται μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Τέλος, παρέχονται τα αποτελέσματα από τις παραπάνω διαδικασίες. Αντικείμενο του κεφαλαίου 6 της παρούσας εργασίας είναι μια δοκιμασία υβριδοποίησης σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης. Η ανίχνευση και η ταυτοποίηση των συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA βασίζεται σε επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο- ανιχνευτή, ειδικό για κάθε ξηρό καρπό. Πιο αναλυτικά, κάθε ενισχυμένο προϊόν PCR είναι βιοτινυλιωμένο και υβριδοποιείται με το ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτή, ο οποίος φέρει μια πολυ-(dΑ) ουρά στο ένα άκρο του. Στη συνέχεια τα υβρίδια δεσμεύονται από πολύ-(dT) αλληλουχίες που είναι ακινητοποιημένες σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης λόγω (dA)/(dT) υβριδοποίησης. Η ανίχνευση των υβριδίων γίνεται με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης (SA-ALP) μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Η προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος του ενζύμου οδηγεί στην παραγωγή χημειοφωταύγειας, η ένταση της οποίας είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση της αλληλουχίας στο δείγμα. Η μέθοδος εφαρμόστηκε για την ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA των ξηρών καρπών αραχίδων, φουντουκιού και καρυδιού, τόσο σε ωμούς και ψημένους ξηρούς καρπούς, όσο και σε επεξεργασμένα τρόφιμα. Πρότυπες καμπύλες αναφοράς κατασκευάστηκαν και για τους τρείς ξηρούς καρπούς, ενώ το όριο ανίχνευσης της προτεινόμενης μεθόδου ήταν 1,4 ρΜ και για τις τρεις αλληλουχίες DNA, ενώ κατέστη δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση και των τριών ειδών σε ποσοστό 0,01%. Τέλος, στο κεφάλαιο 7 παρουσιάζονται πολλαπλές φθορισμομετρικές δοκιμασίες υβριδοποίησης DNA σε εναιώρημα φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου. Κάθε μικροσφαιρίδιο περιέχει δύο φθορίζουσες χρωστικές σε συγκεκριμένη αναλογία και με αυτόν τον τρόπο έχει καταστεί ένα φασματικά κωδικοποιημένο στερεό υπόστρωμα για την εκτέλεση δοκιμασιών υβριδιποίησης. Ειδικά ολιγονουκλεοτίδια – ανιχνευτές προσδένονται ομοιοπολικά στην επιφάνεια κάθε μικροσφαιριδίου. Η αλληλουχία του DNA υβριδοποιείται με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια. Τα υβρίδια ανιχνεύονται με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης- φυκοερυθρίνης. Τα μικροσφαιρίδια αναλύονται τέλος μέσω ενός κυτταρομετρητή ροής ο οποίος περιλαμβάνει δύο δέσμες λέιζερ. Η μία δέσμη λέιζερ είναι υπεύθυνη για την ταξινόμηση των μικροσφαιριδίων, ενώ η δεύτερη δέσμη διεγείρει τη φυκοερυθρίνη. Η ένταση του εκπεμπόμενου φθορισμού είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του προϊόντος PCR. Πρότυπες καμπύλες αναφοράς κατασκευάστηκαν και για τους τρείς ξηρούς καρπούς, ενώ το όριο ανίχνευσης της προτεινόμενης μεθόδου ήταν 1,4 ρΜ και για τις τρεις αλληλουχίες DNA, ενώ κατέστη δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση και των τριών ειδών σε ποσοστό 0,02%.
Abstract (translated): Food allergies are defined as an immune response to food proteins. Food allergens present in foodstuffs have to be labelled according to the European Union. Food industry has established internal threshold values referring to allergens added by recipe, as well as allergens present due to cross-contamination. Many analytical methods have been reported for the detection of various allergens based on its protein or nucleic acid content. However, intensive processed and heat-treated foods are characterized by a higher degradation of proteins compared to DNA. Thus, DNA is preferred due to the fact that is efficiently extracted from food matrices and is less affected by extraction conditions or food procession as compared to proteins. In recent years, the number of proposed DNA methods for food allergen detection has been raised. The aim of this study is the detection of various nuts that are present even in traces in foods by two methods. Τwo methods have been developed a chemiluminescent and a fluorescent method. These methods were applied for the detection of peanut, hazelnut and walnut. In chapter 1, the allergens and especially food allergens are presented, as well as the methods for detection of food allergens. These methods are based on proteins or DNA analysis. Another detection method is Mass Spectrometry. In this chapter, the principles of polymerase chain reaction (PCR) are described. PCR is the most widely used technique for the exponential amplification of specific DNA sequences and as a result it has become an essential step of every method for nucleic acid analysis. Chapter 2 contains the principles of chemiluminescence. Typical reactions of chemiluminescence and bioluminescence are also indicated. The objective of chapter 3 is the detection of nucleic acids in microtiter wells. The various solid substrates with which these wells are made of, are also presented. Finally, various detection methods are also reported. Chapter 4 describes the principles and instrumentation of flow cytometry which is a powerful analytical technique for the study of the properties of microparticles, including cells and synthetic microspheres. In chapter 5, the isolation of genomic material from nuts, and from processed food, such as cookies is presented. Cookies were prepared containing all three nuts in amounts of 0.01-5 %. The amplification of specific DNA sequences of nuts’ genome by Polymerase Chain Reaction (PCR) is also described. In chapter 6, a hybridization assay on microtiter wells is reported. The detection and confirmation of the particular sequences of double stranded DNA is based on labeled oligonucleotide-probes, specific for each nut. In details, each amplified PCR product, that is biotinylated, is hybridized to the specific oligonucleotide-probe, which carries a poly (dA) tail at one end. The hybrids are then captured by poly (dT) sequences immobilized on the microtiter wells and detected by a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (SA_ALP) via streptavidin-biotin interaction. Finally, the chemiluminometric substrate of ALP, PPD (4- methoxy-4-(3-phosphatephenyl) spiro [1, 2-dioxetane-3, 2’-adamantane], disodium salt), is added and the produced chemiluminescence is measured by a luminometer. The intensity of the measured chemiluminescence is proportional to the concentration of the corresponding DNA sequence. The method was applied for the detection of peanut, hazelnut and walnut. The limit of detection of the proposed method was 1.4 pM for all the three DNA sequences. As low as 0.01% of each nut present in the cookie mixtures were detected by this method. Finally, in chapter 7, multiplex fluorometric hybridization assay for DNA analysis using a suspession of spectrally distinct polysterene microspheres (beads), is described. Each microsphere contains two fluorescence dyes at specific ratios and producing spectrally encoded different sets of microspheres for the performance of a heterogeneous hybridization assay. Specific probes are attached covalently on the surface of each bead. The target DNA is hybridized with the immobilized probes and the hybrids are detected by using another fluorescent label via a streptavidin - phycoerythrin conjugate. The suspension of microspheres is interrogated by flow cytometer by laser induced fluorescence using two lasers. One laser beam is responsible for the classification of microspheres, while the second beam excites phycoerythrin. The intensity of the emitted fluorescence is proportional to the concentration of the PCR product. The method was applied for the detection of peanut, hazelnut and walnut. The limit of detection of the proposed method was 1.4 pM for all the three DNA sequences. As low as 0.02% of each nut present in the cookie mixtures were detected by this method.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Christopoulou(chem).pdf2.9 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons