Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/10832
Title: Διερεύνηση μοριακών μηχανισμών επαγωγής ΕΜΤ σε καρκινικά κύτταρα μαστού
Other Titles: Investigation of the molecular mechanisms underlying EMT in breast cancer cells
Authors: Καραλής, Θεόδωρος
Keywords: Καρκίνος του μαστού
Υαλουρονικό όξύ
Θεϊική ηπαράνη
Keywords (translated): Breast cancer
EMT
Wnt
β-catenin
CD44
Hyaluronan
Heparan sulfate
Abstract: Στην παρούσα Μεταπτυχιακή Εργασία χρησιμοποιήθηκαν MCF-7 επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα μαστού στα οποία η καταστολή της γονιδιακής έκφρασης του ERα προκάλεσε έντονη επαγωγή EMT (μετάπτωση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο), η οποία συνοδεύτηκε από αλλαγές τόσο στις λειτουργικές ιδιότητες των κυττάρων όσο και στην έκφραση και δραστικότητα μορίων του εξωκυττάριου χώρου. Με στόχο να μελετηθούν οι μοριακοί μηχανισμοί επαγωγής ΕΜΤ στα ERα-κατεσταλμένα καρκινικά μαστού (MCF-7/SP10+), μελετήθηκε το κανονικό μονοπάτι του Wnt/β-catenin. Παρατηρήθηκε μετατόπιση της β-catenin στον πυρήνα των MCF-7/SP10+ κυττάρων η οποία ανεστάλη με τη χρήση εξειδικευμένου αναστολέα του μονοπατιού υποδεικνύοντας ότι το Wnt/β-catenin μονοπάτι είναι ενεργό σε αυτά τα κύτταρα, σε αντίθεση με τα MCF-7/c όπου παρατηρήθηκε εντοπισμός της β-catenin στις διακυτταρικές συνάψεις. Δεδομένου του ρόλου των μεμβρανικών HSPGs, όπως οι γλυπικάνες, συνδεκάνες αλλά και ο CD44, ως συνυποδοχέων, μελετήθηκε η πιθανή εμπλοκή τους στην ρύθμιση του Wnt/β-catenin μονοπατιού. Η εξειδικευμένη αποικοδόμηση των αλυσίδων HS οδήγησε σε αναστολή της συσσώρευσης της β-catenin στον πυρήνα των MCF-7/SP10+ κυττάρων, υποδεικνύοντας πιθανό ρόλο των HSPGs στην ενεργοποίηση του μονοπατιού. Η διαφορετική επίπτωση των δύο πειραματικών προσεγγίσεων στα λειτουργικά χαρακτηριστικά των ERα-κατεσταλμένων κυττάρων υποδηλώνει ότι διαφορετικοί μοριακοί μηχανισμοί λαμβάνουν χώρα σε κάθε περίπτωση. Ο κύριος υποδοχέας του υαλουρονικού οξέος (ΗΑ), CD44, αποτελεί γονίδιο-στόχο αλλά και ρυθμιστή του μονοπατιού Wnt/β-catenin. Ως εκ τούτου, προκειμένου να διερευνηθεί ο πιθανός του ρόλος στην ενεργοποίηση του Wnt/β-catenin, μελετήθηκε το σύστημα HA/CD44 στα ERα-κατεσταλμένα κύτταρα. Βρέθηκε ότι η σύνθεση του ΗΑ αυξάνεται σημαντικά στα MCF-7/SP10+ σε σχέση με τα MCF-7/c κύτταρα, πιθανότατα ως αποτέλεσμα της εξειδικευμένης αυξορύθμισης της γονιδιακής έκφρασης της HAS2 που βρέθηκε αυξημένη κατά 200-φορές. Ταυτοχρόνως, σημαντική αύξηση σημειώνεται τόσο στη γονιδιακή όσο και στην πρωτεϊνική έκφραση των CD44s, CD44v3, CD44v6 στα MCF-7/SP10+ κύτταρα. Οι μελέτες ανοσοφθορισμού των HA/CD44 έδειξαν μερικό συνεντοπισμό τους ιδιαίτερα σε προεκβολές των κυττάρων (lamellipodia) οι οποίες χρησιμεύουν στην κυτταρική κίνηση. Αξιοσημείωτη ήταν η έντονη ενδοκυττάρια εστιασμένη χρώση ΗΑ σε περιοχές πλησίον του πυρήνα, οι οποίες πιθανότατα αντιστοιχούν στο σύμπλεγμα Golgi. Δεδομένης της μειωμένης έκφρασης των HSPGs, γλυπικανών και συνδεκανών, και ταυτόχρονα της αύξησης των CD44s/CD44v και του ΗΑ στα ERα-κατεσταλμένα κύτταρα, κρίνεται πιθανή η εμπλοκή του συστήματος HA/CD44 στην ενεργοποίηση του Wnt/β-catenin τόσο μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με συστατικά του μονοπατιού όσο και με HS-εξαρτώμενο τρόπο.
Abstract (translated): In the present master thesis MCF-7 epithelial breast cancer cells were used, which after ERα gene silencing, undergo enhanced EMT (Epithelial-to-mesenchymal transition) induction, acquiring a new aggressive mesenchymal phenotype. In order to study the underlying molecular mechanisms which are responsible for the EMT induction in the ERα-suppressed breast cancer cells (MCF-7/SP10+), the canonical Wnt/β-catenin pathway was investigated. In MCF-7/SP10+ nuclear accumulation of β-catenin was observed, which was inhibited after treatment with a specific Wnt secretion inhibitor. In contrast, in parental MCF-7/c cells β-catenin was localized mainly in cell-cell junctions, suggesting that Wnt/β-catenin pathway is activated in ERα-suppressed cells. Due to the well established role of cell surface HSPGs, such as glypicans, syndecans and CD44, as co-receptors, their possible implication in the activation of Wnt/β-catenin was examined. Enzymatic degradation of HS chains, inhibited nuclear accumulation of β-catenin in MCF-7/SP10+ cells, thus suggesting a possible role of HSPGs in the activation of this signaling pathway. The different effect observed in the functional properties of ERα-suppressed cells, between the two experimental methods, suggests that different underlying molecular mechanisms are responsible for each case. The hyaluronic acid receptor, CD44, is characterized as a target gene, as well as a modulator of Wnt/β-catenin pathway. In order to clarify the possible role of CD44 in the activation of this pathway, HA/CD44 expression and distribution was studied in MCF-7/c and MCF-7/SP10+ cells. ERα-suppressed cells showed an increased hyaluronic acid synthesis (10-25-fold), observation that probably is associated with the increased expression of HAS2 (200-fold) in these cells. Also, increased mRNA and protein expression of CD44s, CD44v3 and CD44v6 was observed in MCF-7/SP10+ cells. Immunofluorescence studies, revealed a partial colocalization of HA/CD44 in cellular protrusions, probably lamellipodia, which are essential for cellular movement. Notably, HA stain was also found to be present in perinuclear compartments, which probably correspond to Golgi network. Due to the fact that expression of HSPGs, glypicans and syndecans, has been found to be downregulated in MCF-7/SP10+, the possible role of HA/CD44 as a positive modulator of Wnt/β-catenin pathway is suggested, through protein-protein interaction, as well as an HS-dependent manner.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Master_Καραλής Θεόδωρος.pdf3.7 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons