Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/11764
Title: Η συμβολή της επαναντιγραφής στη γονιδιακή ενίσχυση και την εμφάνιση ανθεκτικότητας σε τοξικούς παράγοντες στο ζυμομύκητα Schizosaccharomyces pombe
Other Titles: The contribution of rereplication to gene amplification and the emergence of resistance to toxic agents in Schizosaccharomyces pombe
Authors: Κασελίμη, Ειρήνη
Keywords: Σχιζοσακχαρομύκητας
Επαναντιγραφή
Γονιδιακή ενίσχυση
Γονιδιωματική αστάθεια
Εξέλιξη
Keywords (translated): Schizosaccharomyces pombe
Rereplication
Gene amplification
Genomic instability
Evolution
Abstract: Η εκκίνηση της αντιγραφής του ευκαρυωτικού γενετικού υλικού είναι μία διαδικασία δύο σταδίων. Κατά το πρώτο στάδιο, στις διάσπαρτες στο γονιδίωμα αφετηρίες, και με το τέλος της μίτωσης, δεσμεύονται πρωτεϊνικά σύμπλοκα τα οποία σταδιακά εμπλουτίζονται, καθώς πλησιάζει η μετάβαση G1/S. Τα σύμπλοκα αυτά είναι απαραίτητα για την εκκίνηση της αντιγραφής και η παρουσία τους στις αφετηρίες παρέχει την άδεια για έναρξη της αντιγραφής (αδειοδότηση). Ωστόσο, αυτή η άδεια δεν ταυτίζεται με την εκκίνηση της αντιγραφής. Προκειμένου αυτή να λάβει χώρα, θα πρέπει ορισμένες κρίσιμες υπομονάδες του συμπλόκου που φέρει πάνω της η αδειοδοτημένη αφετηρία να ενεργοποιηθούν μέσω φωσφορυλίωσης (δεύτερο στάδιο). Με αυτήν τη σταδιοποίηση της διαδικασίας εκκίνησης της αντιγραφής το κύτταρο εξασφαλίζει ότι κάθε αφετηρία της αντιγραφής θα ενεργοποιηθεί μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και ταυτόχρονα συντονίζει τη διαδοχή των φάσεων S και Μ. Απορρύθμιση της φυσιολογικής διαδικασίας αδειοδότησης της αντιγραφής προκαλεί επαναπυροδότηση αφετηριών κατά τη διάρκεια της ίδιας φάσης S και επαναντιγραφή του γονιδιώματος (re-replication). Η επαναντιγραφή προκαλεί βλάβες στο DNA οι οποίες σχετίζονται άμεσα με τη γονιδιωματική αστάθεια, την εμφάνιση δηλαδή αλλαγών/ανακατατάξεων στο γενετικό υλικό. Δεδομένου ότι με την επαναντιγραφή τοπικά κάποιες περιοχές του DNA εμφανίζονται σε πολλαπλά αντίγραφα επιδιώξαμε να διερευνήσουμε την πιθανή συμβολή της επαναντιγραφής στην εμφάνιση γονιδιακών διπλασιασμών και ενισχύσεων (gene duplications/amplifications). Προς αυτήν την κατεύθυνση χρησιμοποιήσαμε τον οργανισμό-μοντέλο Schizosaccharomyces pombe και μέσω δοκιμασιών ανθεκτικότητας σε δύο τοξικούς παράγοντες (αμινοτριαζόλη, χλωριούχο λίθιο) εκτιμήσαμε τη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών αποικιών στην περίπτωση που τα κύτταρα αντέγραφαν φυσιολογικά το DNA τους και στην περίπτωση που είχε επαχθεί το φαινόμενο της επαναντιγραφής. Η επαναντιγραφή προκλήθηκε μέσω υπερέκφρασης του αδειοδοτικού παράγοντα Cdc18. Όπως διαπιστώθηκε μέσω Real-Time PCR, οι ανθεκτικές αποικίες που αναδύονται σε κάθε περίπτωση φέρουν σε πολλαπλά αντίγραφα γονίδια που σχετίζονται με την αντιμετώπιση του περιοριστικού παράγοντα (his5, sod2). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας, στην περίπτωση που είχε προηγηθεί επαναντιγραφή στα κύτταρα, εμφανίζονταν πολύ πιο συχνά ανθεκτικές στους τοξικούς παράγοντες αποικίες σε σχέση με την περίπτωση που η αντιγραφή διεξαγόταν φυσιολογικά. Επιπλέον, μελετήσαμε το ρόλο της πρωτεΐνης Rad3 στη συχνότητα εμφάνισης του φαινοτύπου ανθεκτικότητας. Η πρωτεΐνη αυτή είναι κομβική για την ενεργοποίηση σημείων ελέγχου που σταματούν τον κυτταρικό κύκλο, όταν υπάρχουν βλάβες στο γενετικό υλικό, προκειμένου να εκκινήσει η διαδικασία επιδιόρθωσής τους. Από τα πειράματα αυτά συμπεραίνουμε ότι η ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου είναι καταλυτική για την εμφάνιση ανθεκτικών αποικιών με αυξημένη συχνότητα μετά από επαναντιγραφή του DNA. Η ερευνητική αυτή εργασία παρέχει πειραματικά δεδομένα που αναδεικνύουν την επαναντιγραφή ως πιθανό μηχανισμό γένεσης γονιδιακών διπλασιασμών και ενισχύσεων με σημαντικές προεκτάσεις στην Εξελικτική Βιολογία αλλά και στη βιολογία ασθενειών του ανθρώπου.
Abstract (translated): The initiation of eukaryotic DNA replication is a two-step process. In the first step, after the end of mitosis, protein complexes bind to the dispersed throughout the genome origins of replication and are being gradually enriched towards G1/S transition. These complexes are necessary for the initiation of replication and their presence on the origins provides a license for replication outset (licensing). For this to happen, it is vital that some critical subunits of the origin protein complex are activated through phosphorylation (second step). With the above staging of the initiation of DNA replication the cell ensures that every origin will be activated only once during the cell cycle and simultaneously coordinates the consecution of the S and M phases. Deregulation of the physiological licensing process leads origins to refire during the same S phase and genomic origins to be re-replicated. Re-replication causes DNA lesions which are directly connected to genomic instability, that is to the appearance of realignments in the genetic material. Given that with re-replication some genomic regions appear locally in multiple copies, we pursued to investigate the possible contribution of re-replication in the occurrence of gene duplications and amplifications. Towards that goal we used the model-organism Schizosaccharomyces pombe and through resistance assays against two different toxic agents (aminotriazole, lithium chloride), we assessed how frequently resistant colonies appeared with or without having induced re-replication. Re-replication was induced through Cdc18 overexpression. Using Real-Time PCR, we ascertained that in both cases resistant colonies arose mainly through amplification of genes (his5, sod2) correlated with facing the presence of the limiting factors. According to our experimental results resistant colonies appeared with much higher frequency when re-replication had taken place in comparison with the case of physiological DNA replication. Additionally, we checked the role of Rad3 protein on how frequently the resistance-phenotype appears. This protein is central to checkpoint activation that will stop the cell cycle when DNA lesions exist, for the repair functions to be initiated. From these experiments, we concluded that checkpoint activation during re-replication is of great importance for the resistant colonies to appear with a high frequency after re-replication. Our research study provides experimental data that highlight a possible mechanism by which gene duplications and amplifications arise thus being crucial for both Evolutionary Biology and for the biology of various human diseases.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Nemertes_Kaselimi(med).pdf5.02 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.