Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/14201
Title: Validation of activity-based probes (ABPs) and inhibitors specific for the KLK6 protease in vitro
Other Titles: Αξιολόγηση ιχνηθετών ενεργότητας και αναστολέων ειδικών για την πρωτεάση KLK6 σε in vitro συστήματα
Authors: Γιαννακοπούλου, Χριστίνα
Keywords: Kallikrein-related peptidase 6
Activity based probes
Theranostics
Keywords (translated): Ανθρώπινη καλλικρεΐνη 6
Abstract: Kallikrein-related peptidase 6 (KLK6 for human; Klk6 for mouse) is a trypsin-like serine protease, member of the family of kallikrein-related (KLKs) serine proteases. Certain KLKs have been linked to various diseases, including autoimmune and inflammatory skin diseases, neurodegeneration, and multiple types of cancer. In particular KLK6 was found dysregulated in several cancer types, as well as in Parkinson disease and Alzheimer’s disease. Until now, little progress has been achieved in establishing specific inhibitors for the KLK6 protease. On the other hand, Activity-Based Probes (ABPs) are chemical molecules that bind specifically to the active form of an enzyme but not to its inactive forms, e.g. the corresponding pro-enzyme, etc. Thus, ABPs are unique tools for detection and quantification of active enzymes with various applications as research and molecular diagnostic tools. ABPs can also act as inhibitors their specific protease, thus, they provide opportunities for the development of theranostic agents. Typically, ABPs are comprised of [a] a reactive group that binds to the active site of the enzyme, [b] a recognition sequence or linker, which interacts selectively with the side pockets of the recognized protease, and [c] a detection tag, typically a fluorophore or biotin. The main aim of this study was to evaluate two KLK6-ABP-inhibitors that are phosphonate derivatives of arginine for their inhibitory activity and selectivity against active KLK6 but not against other KLK proteases that are co-expressed in human skin (and other tissues) like KLK5 and KLK13, for example. For this, rKLK6 R80Q, rKlk6 and rKLK5 were produced in the yeast Pichia pastoris and purified to homogeneity by a two-step chromatography protocol, i.e. by hydrophobic interaction chromatography followed by cation exchange chromatography. The activity of the purified recombinant proteins was confirmed by gel zymography and also against the fluorogenic protease substrate Z-Arg-Phe-AMC. Following, the inhibitory activity of two synthetic compounds, i.e. benzyl(1-(diphenoxyphosphoryl)-4guanidino butyl)carbamate (Z-Arg(P)-(OPh)2) and diphenyl(1-amino4guanidinobutyl) phosphonate (H2N-Arg(P)-(OPh)2) against the purified recombinant proteases was assayed and kinetic constants were calculated. Indeed, we found that both these compounds can inhibit KLK6 activity efficiently, nevertheless, they could also inhibit trypsin, suggesting lack of selectivity for KLK6. The benzyl(1-(diphenoxy phosphoryl)-4-guanidinobutyl)carbamate was a more potent inhibitor than the diphenyl(1-amino-4-guanidinobutyl)phosphonate, and the calculated kinact/KI constants were 1987.43 M-1 s-1 and 65 M-1 s-1, respectively. As part of the current study, a sandwich ELISA specific for KLK6 was developed using three commercial α-KLK6 antibodies and one α-KLK6 IgYs polyclonal produced in-house (Sotiropoulou et al., 2012), that were compared in parallel to optimize the assay. The established ELISA exhibited a dynamic range of 3-35 ng/ml and a lower detection limit of 1.3 ng/ml. This ELISA assay will find wide applications for the quantification of KLK6 in biological fluids but also in clinical samples given that aberrant KLK6 expression/activity has been associated with various human diseases. While total, i.e. active + inactive KLK6 in a given sample can be quantified by the developed ELISA, the % corresponding to the active KLK6 enzyme in the same sample can be quantified by a KLK6-ABP based ELISA. In conclusion, synthetic phosphonate analogs of arginine proved potent but not selective inhibitors of KLK6. Modification of these compounds is ongoing to achieve selectivity, which may eventually lead to an optimized KLK6-ABP-inhibitor for theranostic purposes.
Abstract (translated): Η ανθρώπινη καλλικρεΐνη 6 (KLK6, human kallikrein-related peptidase 6 και Klk6, mouse kallikrein-realated peptidase 6) είναι μια σερινοπρωτεάση τύπου θρυψίνης, και μέλος της οικογένειας των ανθρώπινων καλλικρεϊνών (KLKs). Ορισμένες KLKs έχουν συνδεθεί με ποικίλες ασθένειες, όπως αυτοάνοσα νοσήματα και φλεγμονώδεις δερματικές παθήσεις, νευροεκφυλιστικές ασθένειες και διάφορους τύπους καρκίνου. Συγκεκριμένα, η έκφραση της πρωτεάσης KLK6 έχει βρεθεί απορρυθμισμένη σε διάφορους τύπους καρκίνου, καθώς και στην νόσο του Parkinson και την νόσο Alzheimer. Μέχρι τώρα, έχει σημειωθεί μικρή πρόοδος στην ανάπτυξη ειδικών αναστολέων για την πρωτεάση KLK6. Οι ιχνηθέτες ενεργότητας ABPs (Activity-Based Probes) είναι χημικά μόρια που συνδέονται ειδικά με τη δραστική μορφή ενός ενζύμου αλλά όχι με τις ανενεργές μορφές του, όπως π.χ. το αντίστοιχο προ-ένζυμο, κ.λπ. Έτσι, οι ιχνηθέτες ABP είναι μοναδικά εργαλεία για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό αποκλειτικά της ενεργής μορφής ενός ενζύμου με διάφορες εφαρμογές ως ερευνητικά και μοριακά διαγνωστικά εργαλεία. Οι ιχνηθέτες ABPs μπορούν, επίσης, να δράσουν ως ειδικοί αναστολείς της πρωτεάσης που αναγνωρίζουν, έτσι, μπορούν να αξιοποιηθούν για την ανάπτυξη θεραπευτικών παραγόντων. Συνήθως, οι ιχνηθέτες ΑΒΡs αποτελούνται από [α] μια ομάδα, η οποία αλληλεπιδρά ειδικά με το ενεργό κέντρο του ενζύμου, [β] μια ακολουθία αναγνώρισης (ή συνδέτη), η οποία αλληλεπιδρά με τις πλευρικές θέσεις της πρωτεαάσης, και [γ] μια ετικέτα ανίχνευσης, που τυπικά είναι ένα φθορίζον μόριο ή βιοτίνη. Ο κύριος στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθούν δύο KLK6-ABP-αναστολείς που είναι παράγωγα φωσφονικού άλατος της αργινίνης, ως προς την ανασταλτική δράση και την εκλεκτικότητά τους έναντι της KLK6, αλλά όχι έναντι άλλων KLK ενζύμων που συν-εκφράζονται στο ανθρώπινο δέρμα (καθώς και σε άλλους ιστούς), όπως οι πρωτεάσες KLK5 και KLK13. Για τον σκοπό αυτό, οι ανασυνδυασμένες ενεργές πρωτελασες rKLK6 R80Q, rKlk6 και rKLK5 παρήχθησαν στην ζύμη Pichia pastoris και ακολούθως καθαρίσθηκαν με πρωτόκολλο χρωματογραφίας δύο σταδίων, δηλαδή με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ακολουθούμενη από ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία κατιόντων. Η ενεργότητα των καθαρισμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε με ζυμογραφία πηκτής, καθώς και με το φθορίζον συνθετικό υπόστρωμα Z-Arg-Phe-AMC. Στην συνέχεια, προσδιορίσθηκε η ανασταλτική ικανότητα δύο συνθετικών ενώσεων, δηλαδή του βενζυλο(1-(διφαινοξυφωσφορυλο)-4γουανιδινοβουτυλο)καρβαμικού άλατος (Z-Arg(P)-(OPh)2) και του διφαινύλιο(1-αμινο4γουανιδινοβουτύλιο)φωσφονικού άλατος (H2N-Arg(P)-(OPh)2), έναντι των παραχθέντων πρωτεασών, και υπολογίσθηκαν οι κινητικές σταθερές. Πράγματι, βρέθηκε ότι και οι δύο αυτές ενώσεις αναστέλλουν αποτελεσματικά την ενεργότητα της KLK6, αλλά επίσης αναστέλλουν την θρυψίνη, υποδηλώνοντας ότι δεν είναι εκλεκτικοί για την πρωτεάση KLK6. Το βενζυλο(1- (διφαινοξυ φωσφορυλο)-4-γουανιδινοβουτυλο) καρβαμικό άλας ήταν πιο ισχυρός αναστολέας από το διφαινυλ(1-αμινο-4-γουανιδινοβουτυλο) φωσφονικό, και οι σταθερές Kinact/ΚΙ που υπολογίσθηκαν ήταν 1987.43 Μ-1 s-1 και 65 Μ -1 s-1, αντίστοιχα. Τέλος, στο πλαίσιο της τρέχουσας μελέτης, αναπτύχθηκε μία τεχνική ELISA τύπου σάντουιτς ειδική για την KLK6, χρησιμοποιώντας τρία εμπορικώς διαθέσιμα αντισώματα α-KLK6 και ένα πολυκλωνικό αντίσωμα α-KLK6 IgYs που είχε παραχθεί προηγούμενα (Sotiropoulou et al., 2012), τα οποία συγκρίθηκαν παράλληλα προς βελτιστοποίηση της δοκιμής. Η αναπτυχθείσα δοκιμή ELISA είχε δυναμικό εύρος μέτρησης 3-35 ng/ml και κατώτατο όριο ανίχνευσης στα 1,3 ng/ml, και μπορεί να βρει ευρείες εφαρμογές για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ενζύμου KLK6 σε βιολογικά υγρά, αλλά και σε κλινικά δείγματα δεδομένου ότι η έκτοπη έκφραση/ενεργότητα της πρωτεάσης KLK6 έχει συσχετισθεί με διάφορες ανθρώπινες ασθένειες. Ενώ η ολική (ενεργή+ ανενεργές μορφές) πρωτεΐνη KLK6 σε ένα δείγμα μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με την αναπτυχθείσα δοκιμή ELISA, το % που αντιστοιχεί στο ενεργό ένζυμο KLK6 στο ίδιο δείγμα είναι δυνατόν να ποσοτικοποιηθεί μόνον με δοκιμή τύπου-ELISA, όπου αντί αντισώματος χρησιμοποιείται ειδικός ιχνηθέτης KLK6-ABP. Συμπερασματικά, τα συνθετικά φωσφονικά ανάλογα της αργινίνης που δοκιμάσθηκαν αποδείχθηκαν ισχυροί αλλά όχι εκλεκτικοί αναστολείς της ενεργότητας της πρωτεάσης KLK6. Η χημική τροποποίηση των ενώσεων που μελετήθηκαν βρίσκεται σε εξέλιξη για να επιτευχθεί η σύνθεση εκλεκτικών αναστολέων της KLK6, η οποία μπορεί να οδηγήσει στην τελική παραγωγή βελτιστοποιημένου αναστολέα KLK6-ABP για θεραποδιαγνωστικούς σκοπούς.
Appears in Collections:Τμήμα Φαρμακευτικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
MSc_ChristinaGiannakopoulou.pdf9.1 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.