Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/15670
Title: Μελέτη του παράγοντα έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 3 (eIF3) σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μελανώματος με τη χρήση εργαλείων γονιδιωματικής επεξεργασίας
Other Titles: Study of the eukaryotic initiation factor of protein synthesis 3 (eIF3) in melanoma cell lines utilizing genomic processing tools
Authors: Αλεξίου, Ανάργυρος
Keywords: Πρωτεϊνοσύνθεση
Μελάνωμα
Παράγοντας έναρξης 3 (eIF3)
Ανθεκτικό μελάνωμα
Μετάφραση
Keywords (translated): Protein synthesis
Melanoma
Eukaryotic initiation factor 3 (eIF3)
Melanoma resistance
Translation
CRISPR/Cas13
Abstract: Το μελάνωμα αναφέρεται στην ανάπτυξη κακοηθών όγκων που προέρχονται από το συνεχή πολλαπλασιασμό καρκινικών μελανοκυττάρων. Αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους δερματικούς καρκίνους με υψηλό μεταστατικό δυναμικό και τα τελευταία χρόνια, η συχνότητα εμφάνισής του συνεχώς αυξάνεται. Έχει διαπιστωθεί πως στο 60% περίπου των μελανωμάτων παρουσιάζονται μεταλλαγές στο γονίδιο της κινάσης BRAF με αποτέλεσμα τη συνεχή ενεργοποίηση του καθοδικού μονοπατιού MAPK και την αναπροσαρμογή του μεταγραφικού και μεταφραστικού προγράμματος. Παρότι έχουν αναπτυχθεί πολλές διαφορετικές κλινικές προσεγγίσεις με θετικά πρώιμα αποτελέσματα, όπως η στοχευμένη αναστολή του μεταλλαγμένου BRAF και η ανοσοθεραπεία, μόνο ένα μικρό ποσοστό των ασθενών ανταποκρίνεται μακροχρόνια, με την πλειονότητα να αναπτύσσει ανθεκτικότητα στη θεραπεία. Υπάρχουν ενδείξεις πως τα καρκινικά μελανοκύτταρα διαθέτουν την ικανότητα να προσαρμόζονται σε συνθήκες stress στο μικροπεριβάλλον τους μειώνοντας το μεταβολισμό τους και ασκώντας επιλεκτική μετάφραση των διαφόρων αναγκαίων γονιδίων. Αυτό πιστεύεται πως επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης της έναρξης της μετάφρασης. Το κύτταρο μπορεί να ξεκινήσει τη μετάφραση συγκεκριμένων γονιδίων επιστρατεύοντας διαφορετικούς συνδυασμούς παραγόντων έναρξης της μετάφρασης (eIFs) ή/και με την αναγνώριση διαφορετικών αλληλουχιών έναρξης της μετάφρασης (uORFs ή IRES) στα μετάγραφά τους. Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχουν βρεθεί ικανοί στόχοι που να αποτρέπουν την ανάπτυξη ανθεκτικότητας, υποδηλώνοντας την επιτακτική ανάγκη δημιουργίας ικανών μοντέλων για την εύρεση του μηχανισμού ανθεκτικότητας και των μορίων που συμβάλλουν σε αυτόν. Στην παρούσα διπλωματική έγινε μελέτη σε μοριακό επίπεδο, των πιθανών μηχανισμών που επιστρατεύουν τα ανθεκτικά κύτταρα για να διαφύγουν την επίδραση του αναστολέα BRAFV600E Vemurafenib, τόσο στο επίπεδο της μεταγραφής όσο και στο επίπεδο της μετάφρασης αλλά και τον πιθανό ρόλο που μπορεί να διαδραματίζει ο eIF3 και οι υπομονάδες του στο φαινόμενο αυτό. Για τη δημιουργία ανθεκτικών μοντέλων, χρησιμοποιήθηκαν οι καρκινικές σειρές μελανώματος A375 και Sk-Mel-5, οι οποίες καλλιεργήθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου και ύστερα πραγματοποιήθηκε επιβεβαίωση της ανθεκτικότητας τους με προσδιορισμό του IC50 και της κατάστασης της φωσφορυλίωσης του BRAF/ERK μονοπατιού. Επόμενα πειράματα σε επίπεδο mRNA και πρωτεϊνών, έδειξαν πως οι δύο ανθεκτικές σειρές ακολουθούν διαφορετικές οδούς για την απόκτηση της ανθεκτικότητας ρυθμίζοντας διακριτά την έκφραση και την ενεργοποίηση σημαντικών παραγόντων έναρξης της μετάφρασης αλλά και των σηματοδοτικών μονοπατιών που την ελέγχουν. Τα ανθεκτικά Α375 (VR – Vemurafenib Resistant) παρουσίασαν μειωμένη έκφραση και ενεργοποίηση παραγόντων που ευνοούν τη μετάφραση από καλύπτρα, όπως είναι τα μέλη του συμπλόκου eIF4F αλλά και σημαντική μείωση της ενεργοποίησης της S6 κινάσης μέσω του mTORC1 μονοπατιού. Παράλληλα παρουσίασαν σε μεταγραφικό επίπεδο, αύξηση των αντι-αποπτωτικών μορίων ενώ πειράματα του μεταφραστικού ρυθμού τους έδειξαν σημαντική μείωση στους ολικούς ρυθμούς της πρωτεϊνοσύνθεσής τους. Αντίθετα, τα μετασταστικά Sk-Mel-5 VR παρουσίασαν υψηλή ενεργοποίηση της mTOR σηματοδότησης και ενεργοποίηση παραγόντων που παραπέμπουν στη μετάφραση από καλύπτρα με ταυτόχρονη μείωση αρκετών αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών και αυξημένους μεταγραφικούς ρυθμούς. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και από ανάλυση του πολυσωμικού προφίλ των Sk-Mel-5. Τέλος και στις δύο ανθεκτικές σειρές, παρουσιάστηκε διαφορική έκφραση πολλών υπομονάδων του παράγοντα eIF3, και επιτελέστηκε αποσιώπηση μερικών εξ ’αυτών με τη χρήση του συστήματος CRISPR/Cas13, χωρίς ωστόσο να μελετήθηκε στην παρούσα διπλωματική εργασία ο πιθανός ρόλος τους στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας.
Abstract (translated): Melanoma refers to the development of malignant tumours stemming from the aberrant and continued proliferation of melanocytes. It is one of the most lethal skin cancers with high metastatic potential and in recent years, its incidence is constantly rising. It has been found that in about 60% of melanomas, there are mutations in the BRAF gene leading to the continuous activation of the downstream MAPK pathway and the readjustment of global transcription and translation program. Although many different clinical approaches have been developed with promising early results, such as chemotherapy, targeted inhibition of BRAF mutation and immunotherapy, only a small fraction of patients respond to the treatment in the long term, with the majority developing treatment resistance. There is growing evidence that cancerous melanocytes possess the ability to adapt dynamically to stress and other signals from their microenvironment by reducing their metabolism rates and by selectively translating stress-induced genes. Selective translation is believed to be achieved by regulating translation initiation and/or utilizing alternative ways of translation. Cells can initiate the translation of specific genes by employing different combinations of translation initiation factors (eIFs) and/or by utilizing distinct translation initiation sequences, like upstream open reading frames (uORFs) and internal ribosome entry sites (IRES). However, to date, no satisfactory therapeutic targets have been pinpointed to prevent the development of resistance, underscoring the urgency to develop reliable models for finding the resilience mechanism and the molecules that contribute to it. In the present dissertation, a molecular study was made of the possible mechanisms employed by resistant cells to escape the effect of the inhibitor BRAFV600E Vemurafenib, both at the level of transcription and at the level of translation, but also understanding the putative role of eIF3 and its subunits in this phenomenon. To create resistant models, A375 and Sk-Mel-5 melanoma cancer lines were cultured in increasing concentrations of the drug and then their resistance was confirmed by determining the IC50 values and the phosphorylation status of the BRAF / ERK pathway. Subsequent experiments at the mRNA and protein levels showed that the two resistant cell lines follow different pathways for the acquisition of resistance by distinctly regulating the expression and activation of important translation initiation factors as well as the signaling pathways that mediate it. A375 VR (Vemurafenib Resistant) showed reduced expression and activation of factors that favor cap-dependent translation, such as members of the eIF4F complex, but also a significant reduction in the phosphorylation of S6K via the mTORC1 pathway. Simultaneously, A375 VR cells showed significant increase in many anti-apoptotic molecules at the transcriptional level, while experiments of their translation rate showed a significant decrease in the global rates of protein synthesis. In contrast, the metastatic Sk-Mel-5 VR cell line showed elevated activity of mTOR signaling and activation of factors that refer to cap-dependent translation with simultaneous reduction of several anti-apoptotic proteins and increased transcriptional rates. These results were also confirmed through the polysomal profiling of Sk-Mel-5. Finally, both resistant series exhibited differential expression of many subunits of eIF3, and some of them were silenced via the CRISPR / Cas13 system, without studying in this thesis through their possible role in the development of resistance.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
ΔιπλωματικήΕργασία_Alexiou_Final.pdf4.2 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.