Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/15704
Title: Λειτουργικός χαρακτηρισμός της πρωτεΐνης McIdas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου
Other Titles: Functional characterization of McIdas during the cell cycle
Authors: Τσαρίδου, Σταυρούλα
Keywords: Κυτταρικός κύκλος
Γονιδιωματική σταθερότητα
Keywords (translated): McIdas
Idas
Cell cycle
APC/C
Genome stability
Abstract: Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας στα διαιρούμενα κύτταρα απαιτεί τον αυστηρό συντονισμό της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής διαίρεσης. Αυτές οι διεργασίες ρυθμίζονται μέσω πολλαπλών μηχανισμών οι οποίοι περιλαμβάνουν την ύπαρξη διαφόρων σημείων ελέγχου αλλά και τη σωστή χρονική ιεράρχηση της πρωτεόλυσης βασικών κυτταρικών ρυθμιστών μέσω του συστήματος ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος. Το σύμπλοκο προώθησης της ανάφασης/κυκλόσωμα (APC/C) είναι μια Ε3 λιγάση της ουβικουϊτίνης το οποίο έχει την ικανότητα να αναγνωρίζει και να πολυουβικουιτινιλιώνει μια πληθώρα υποστρωμάτων κατά τη μίτωση και τη G1 φάση οδηγώντας τα στο πρωτεάσωμα για αποικοδόμηση. Οι πρωτεΐνες Geminin, GemC1 και McIdas συγκροτούν μια οικογένεια η οποία συμμετέχει τόσο στην αντιγραφή του DNA όσο και σε διαδικασίες διαφοροποίησης. Η Geminin, το πρώτο μέλος της οικογένειας που χαρακτηρίστηκε, δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της αντιγραφής μέσω του σχηματισμού συμπλόκου με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1. Πιο πρόσφατα, οι πρωτεΐνες GemC1 και McIdas ανακαλύφθηκαν μέσω της ομολογίας που εμφανίζουν με την Geminin στην περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος που διαθέτουν. Ο παράγοντας GemC1 δρα κατά την αντιγραφή του DNA μέσω αλληλεπίδρασης με τον παράγοντα TopBP1 για την στρατολόγηση του Cdc45 στο προεναρκτήριο σύμπλοκο της αντιγραφής. Ο παράγοντας McIdas χαρακτηρίστηκε για τη συμμετοχή του στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω του συμπλόκου που σχηματίζει με την Geminin, καθώς απουσία του οδηγεί στη συσσώρευση καρκινικών κυττάρων στην S φάση και αδυναμία εισόδου στην μίτωση και την ακόλουθη G1 φάση. Έχει δειχθεί ότι ο McIdas αποικοδομείται κατά την ανάφαση μετά την Geminin η οποία αποτελεί γνωστό υπόστρωμα του συμπλόκου προώθησης της ανάφασης. Αδημοσίευτα δεδομένα του εργαστηρίου κατέδειξαν ότι η πρωτεόλυση του McIdas πραγματοποιείται ομοίως από το APC/C. Επιπλέον, εκτοπική έκφραση του McIdas έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ανώμαλων πολυπολικών μιτωτικών ατράκτων και πολυπύρηνων κυττάρων αποκαλύπτοντας τον πιθανό ρόλο του McIdas στο διπλασιασμό των κεντροσωματίων καθώς αυτοί οι φαινότυποι παρατηρούνται χωρίς τη μεσολάβηση κυτταροκίνησης. Πρόσφατες μελέτες στο εργαστήριό μας έδειξαν ότι ο McIdas εντοπίζεται στα κεντριόλια και είναι σημαντικός για τον κύκλο των κεντροσωματίων. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία, μελετήθηκε περαιτέρω ο ρόλος του McIdas κατά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και η σημασία του χρονικού της αποικοδόμησής του για τη λειτουργία του. Για αυτό το σκοπό, στο πρώτο μέρος της εργασίας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα αποσιώπησης του McIdas σε κύτταρα hTERT-RPE1, μια αθανατοποιημένη μη καρκινική κυτταρική σειρά από τον αμφιβληστροειδή και έδειξαν ότι απουσία του McIdas τα κύτταρα συσσωρεύονται στην S ή G2 φάση του κυτταρικού κύκλου. Ύστερα από επώαση με BrdU για μεγάλο χρονικό διάστημα (BrdU cumulative assay) παρατηρήθηκε ότι το σύνολο των κυττάρων που αντιγράφεται και διαιρείται ενεργά παραμένει μειωμένο με την πάροδο του χρόνου υποδεικνύοντας την αναγκαιότητα του McIdas για την ομαλή διεξαγωγή του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός δράσης του χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Για την αποικοδόμηση του McIdas, το N-τελικό του άκρο είναι επαρκές για να καταλύσει τη διαδικασία αναγνώρισης και καταστροφής της πρωτεΐνης κατά τη μίτωση. Στο δεύτερο μέρος αυτής της μελέτης εντοπίστηκαν δύο συντηρημένες αλληλουχίες καταστροφής στο N-τελικό άκρο του McIdas οι οποίες ομοιάζουν με τα γνωστά D-Box και ABBA μοτίβα. Μεταλλάγματα του McIdas για αυτές τις περιοχές αδυνατούν να αποικοδομηθούν κατά την ανάφαση ενώ παράλληλα κυτταρικές σειρές οι οποίες εκφράζουν σταθερά αυτά τα μεταλλάγματα εμφανίζουν ανώμαλους μιτωτικούς φαινοτύπους. Αυτοί περιλαμβάνουν την ύπαρξη χρωματινικών γεφυρών, μικροπυρήνων και πολυπύρηνων κυττάρων. Επιπλέον, με την σταθεροποίηση του McIdas κατά τη μίτωση, προκύπτει αυξημένος αριθμός κεντροσωματίων και πολυπολικών μιτωτικών ατράκτων επιβεβαιώνοντας τη συμμετοχή του McIdas στον διπλασιασμό των κεντροσωματίων. Παρόλα αυτά, φαίνεται ότι δεν επηρεάζεται το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων αυτών. Από όλα τα παραπάνω δεδομένα συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη McIdas είναι ζωτικής σημασίας τόσο για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου όσο και για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας.
Abstract (translated): The maintenance of genome integrity in dividing cells requires the strict coordination between DNA replication and cell division. These processes are controlled by multiple pathways including cell cycle checkpoints and the appropriate timing of degradation of key cell cycle regulators through the ubiquitin-proteasome system (UPS). The Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) is an E3 ubiquitin ligase that recognizes and polyubiquitinates various substrates in mitosis and G1, targeting them for degradation by the proteasome. Geminin, GemC1 and McIdas comprise a protein family that participates both in DNA replication and differentiation decisions. Geminin, the first described member of the family, acts as a negative regulator of DNA replication through its binding with Cdt1. More recently, GemC1 and McIdas were identified because of their homology in their coiled-coil regions with Geminin. GemC1 was characterized as an important replication factor that interacts with TopBP1 for the recruitment of Cdc45 to the pre-initiation complex during the G1/S transition. McIdas was identified as a Geminin binding partner required for cell cycle progression, as McIdas depletion leads to an increased fraction of cancer cells in S-phase and disability to proceed to mitosis and the next G1 phase. McIdas was shown to be degraded at anaphase after Geminin, an established APC/C substrate. Unpublished data of our lab revealed later that McIdas proteolysis is also mediated by APC/C. Moreover, ectopic expression of McIdas resulted in mitotic defects including multipolar spindles and multinuclear cells which implicates a possible role of McIdas in centrosome duplication as these phenotypes are observed without cytokinesis. Recent studies in our lab indeed have shown that McIdas is localized at centrioles and is important for the centrosome cycle. In this study, we aimed to further investigate the role of McIdas during the cell cycle and how the timing of its destruction contributes to its function and normal cell cycle progression. For this purpose, in the first part, loss of function experiments in hTERT-RPE1 cells, an immortalized, non-cancerous cell line from the retina, showed that in the absence of McIdas cells accumulate in S or G2 phase. BrdU cumulative assay revealed also that the proportion of the actively dividing cells is reduced upon McIdas depletion highlighting its role in the cell cycle regulation, but the pathway awaits elucidation. Regarding McIdas degradation, the N-terminus of McIdas is sufficient to confer mitotic specific destruction. In the second part of this thesis, two conserved substrate destruction sequences were detected in the N-terminal region of McIdas, resembling DBox and ABBA motifs. McIdas mutants lacking these two regions failed to be properly degraded during anaphase, while stable cell lines expressing these mutants showed pronounced mitotic defects. These phenotypes included chromosome bridges, micronuclei and multinuclear cells. Moreover, upon McIdas stabilization during mitosis, aberrant numbers of centrosomes and multipolar spindles were observed verifying its role in centrosome duplication. Despite that, it seemed that the cell cycle profile of the cells expressing non degradable forms of McIdas is not affected. The above data suggest that McIdas and its timely degradation during mitosis is essential for normal cell cycle progression and chromosomal stability
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
ΜΔΕ_Τσαρίδου Σταυρούλα.pdf4 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.