Please use this identifier to cite or link to this item:
Title: Non-thermal technologies for the disinfection of food and risk assessment for Public Health
Other Titles: Εναλλακτικές τεχνολογίες απολύμανσης τροφίμων και εκτίμηση κινδύνου για την δημόσια υγεία
Authors: Μπίρμπα, Αγγελική
Keywords: Disinfection
Keywords (translated): Απολύμανση
Abstract: Fruits and vegetables are considered as part of a healthy diet and lifestyle. However, concerns have arisen regarding the microbiological safety of Ready To Eat (RTE) produces due to a number of foodborne outbreaks associated with pathogens. Although strict practices for controlling the safety of RTE produce have been implemented in the fresh produce industry, the current commercial operations rely on a wash treatment with water or with an antimicrobial agent as the only step for reducing microbial populations on fresh produce. However, washing with common sanitizers has been demonstrated to achieve no more than 1-2 log10 reduction in pathogen populations. Recently, much research effort has been put into development to provide multiple-hurdle techniques which enhance produce safety. Thus, non-thermal technologies for the inactivation of microorganisms are of increasing interest to the food industry for the control of spoilage and safety, thus for assuring public health. In this study, the effects of non-thermal disinfection processes, Near UV-Visible light (NUV-Vis), Continuous Ultraviolet Light (UV 254 nm), High Intensity Light Pulses (HILP), Ultrasound (US), as well as conventional sodium hypochlorite (SH) disinfection solutions were used. The effect of the above technologies was tested against bacteria (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis and Listeria innocua) and viruses (Human Adenovirus). More precisely, the bacteria that were used were: E. coli K12, E. coli NCTC 9001 (representative microorganisms for the Enterohaemorrhagic foodborne pathogen E. coli O157:H7), S. aureus NCTC 6571, L. innocua NCTC 11288 (as a surrogate microorganism for the common foodborne pathogen L. monocytogenes), S. Enteritidis NCTC 6676 and HAdV (indicator virus selected as a surrogate of HAV and norovirus). The main scope of this work was to study the efficacy of three light technologies on liquid suspensions. Then, the effect of UV, US, SH and combined technologies were evaluated on their efficiency to disinfect inoculated romaine lettuce, strawberries and cherry tomatoes. Furthermore, the effect of the above technologies on quality (color) and physicochemical characteristics of the RTE produces was evaluated. The physicochemical characteristics tested were Total Antioxidant Capacity (TAC), Total Phenolic Content (TPC) and Ascorbic Acid (AA) concentration. This study demonstrates that the use of alternative non-thermal technologies is effective for inactivation of microorganisms in fresh RTE foods and could be used as an alternative to traditional chlorine immersions. However, the effect of UV and US on quality and nutritional quality retention of RTE foods should be considered before its use as a disinfection technique. As far as non-thermal light technologies are concerned, HIPL treatment inactivated both E. coli and L. innocua more rapidly and effectively than either continuous UV-C or NUV-vis treatments. With HILP at a distance of 2.5 cm from the lamp, E. coli and L. innocua populations were reduced by 3.07 and 3.77 log10 CFU/mL respectively after a 5 sec treatment time, and were shown to be below the limit of detection (<0.22 log10 CFU/mL) following 30 sec exposure to HILP (106.2 J/cm2). Treatment of lettuce with UV reduced significantly the population of E. coli, S.aureus, S. Enteritidis and L. innocua by 1.75, 1.21, 1.39 and 1.27 log10 CFU/g, respectively. Furthermore, more than a 2- log10 CFU/g reduction of E. coli, S. Enteritidis and L.innocua was achieved with US. In strawberries, UV treatment reduced bacteria only by 1–1.4 log10 CFU/g. The maximum reductions of microorganisms, observed in strawberries after treatment with US, were 3.04, 2.52, 5.24 and 6.12 log10 CFU/g for E. coli, S. aureus, S. Enteritidis and L. innocua, respectively. Finally, cherry tomatoes exhibited the best results when treated with non-thermal technologies. For instance, 3.16, 2.62, 3.29, 3.16 log10 CFU/g for E. coli, S. aureus, S. Enteritidis and L. innocua, respectively, were achieved when US treatment was used. UV treatment resulted in 2.39, 2.05, 2.62, 2.56 log10 CFU/g reduction of the above microorganisms. The combined technologies of alternative followed by conventional disinfection technologies resulted in 2-3.50 log10 CFU/g reduction for lettuce and strawberries. However, cherry tomatoes exhibited greater reductions (3.28-4.78 log10 CFU/g reduction). Finally, 1-2 log10 CFU/g log reduction was achieved for lettuce and strawberries when RTE foods were immersed in NaOCl 200ppm solutions, and greater reductions (3-4 log10 CFU/g) were achieved for cherry tomatoes. It was observed that HAdV was inactivated faster when chlorine treatment was used. However, UV non thermal technology found to be more effective for disinfection of HAdV compared to US, achieving a log10 reduction of 2.13, 1.25 and 0.92 for lettuce, strawberry and cherry tomatoes respectively when UV treatment for 30 minutes was implemented, whereas, US treatment for the same treatment period achieved a log10 reduction of 0.85, 0.53 and 0.36 log10 respectively. The sequential use of US and UV was found to be more effective and less time consuming, than when the treatments were used alone, indicating the existence of an additive effect. Treatment with UV and US, for time periods (up to 30 min) did not significantly (p > 0.05) change the color of RTE foods tested. Moreover, it was indicated that no significant differences (p>0.05) were observed as far as TAC is concerned when conventional treatments at different treatment times were used. However, when alternative disinfection treatments were used, an increase in TAC concentration was obvious from the first minutes of treatment. TPC concentration remained constant or was slightly decreased when RTE foods were immersed in NaOCl solutions. However, TPC increased significantly (p<0.05) in all RTE foods when UV and US alternative disinfection technologies were used. The Vit.C content of RTE foods did not exhibit any significant changes during different treatments. However, Vit.C was slightly decreased (p<0.05) when treatments of more than 30 minutes for US, UV and combinations of UV+US occurred. Furthermore, a computerized model was proposed based on critical points which are important during the production of lettuce. More precisely the development of a Decision Support System (DSS) using the theory of Fuzzy Cognitive Maps (FCMs), in order to diagnose the importance of critical control points (concepts) for the food safety and hygiene during the production of salad vegetables (lettuce), was implemented. The methodology described, extracts the knowledge from experts with different scientific background and exploits their experience on the process of lettuce production. The results of this study show that the present software tool can be explored and problems that can arise during the food production chain can be prevented. Generally, it was noted that the effect of each disinfection method is dependent upon the treatment time tested and the type of food. Treatment with UV and US reduced the numbers of selected inoculated bacteria on lettuce, strawberries and cherry tomatoes, which could be good alternatives to other traditional and commonly used technologies such as chlorine and hydrogen peroxide solutions. These results suggest that UV and US might be promising, non-thermal and environmental friendly disinfection technologies for fresh RTE produce industry. Taking everything into consideration, disinfection technologies play an important role in commercial practice in order to prevent the survival of pathogens and lower the risk of contamination thus assuring public health. However, nutritional and quality properties are essential as they can provide a protective role against the development and progression of many diseases and must be considered for the selection of disinfection process parameters.
Abstract (translated): Η κατανάλωση φρούτων και λαχανικών αποτελεί μέρος μίας υγιεινούς δίαιτας και διατροφικού προφίλ γενικότερα. Η Μεσογειακή διατροφή αποτελεί ένα μοντέρνο τρόπο διατροφής η οποία έχει τις ρίζες της στις χώρες της Μεσογείου, όπως η Ελλάδα, η Ισπανία, η Πορτογαλία και η Νότια Ιταλία. Τα βασικά συστατικά που την απαρτίζουν είναι το λάδι, τα λαχανικά, τα δημητριακά, τα φρούτα, τα ψάρια, τα γαλακτοκομικά, και η μικρή κατανάλωση κρέατος (Noah and Truswell, 2001). Ως εκ τούτου, λαχανικά όπως το μαρούλι, οι τομάτες είναι κύρια συστατικά μιας ισορροπημένης διατροφής. Επίσης, φρούτα όπως οι φράουλες προτιμώνται από εκείνους που θέλουν να ακολουθούν την Μεσογειακή Διατροφή αλλά και από αυτούς που θέλουν να προσέχουν την υγεία τους. Το μαρούλι (Lactuca sativa L.) καταναλώνεται κυρίως ως σαλάτα και αποτελεί μία πλούσια πηγή συστατικών ευεργετικών για την υγεία όπως τα φαινολικά, η βιταμίνη C, τα καροτενοειδή και οι χλωροφύλλες (Nicolle et al., 2004). Περιλαμβάνει πολλά μακροστοιχεία (π.χ K, Na, Ca και Mg) και ιχνοστοιχεία (π.χ Fe, Mn, Cu, Zn και Se), τα οποία αποτελούν σημαντικά συστατικά μια σωστής διατροφής (Kawashima & Soares, 2003). Το μαρούλι αποτελεί επίσης μία καλή πηγή φωτοσυνθετικών χρωστικών και άλλων φυτοχημικών τα οποία ωφελούν την διατροφή και διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο στην παρεμπόδιση πολλών οξειδωτικών- σχετιζόμενων με το στρες- ασθενειών (Llorach et al., 2008). Οι φράουλες, είναι πλούσιες σε μία σειρά φυτοχημικών, ιδιαίτερα των φαινολικών συστατικών, κατέχοντας υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα (Häkkinen et al., 1999, Koponen et al., 2007). Επίσης έχουν μεγάλη περιεκτικότητα σε βιταμίνη C (60-100 mg/100 g τροφίμου) και σε ανθοκυανίνες, ειδικά πελαργονιδίνη-3-γλυκοζίτη (pg-3-gluc) και κυανιδίνη-3-γλυκοζίτη (CyA-3-gluc). Ως εκ τούτου, η φράουλα θεωρείται ως μια σημαντική διαιτητική πηγή ενώσεων που προάγουν την υγεία (Koponen et al., 2007). Οι τομάτες αποτελούν μία καλή πηγή βιταμινών (βιταμίνη Α, βιταμίνη C, και άλλων βιταμινών) καθώς και μεταλλικών στοιχείων (νάτριο, ασβέστιο, φώσφορος, σίδηρος), και ινών, πρωτεϊνών και λιπών. Η τομάτα είναι μία καλή πηγή αντιοξειδωτικών όπως το λυκοπένιο. Είναι γνωστό ότι το λυκοπένιο και οι ίνες είναι ευεργετικές στην ανθρώπινη υγεία, όταν καταναλώνονται ως μέρος μια ισορροπημένης διατροφής (Canene-Adams et al., 2005). Σύμφωνα με μελέτες το λυκοπένιο έχει χαρακτηριστεί για τις αντιφλεγμονώδεις, αντιμεταλλαξιγόνες και αντικαρκινικές ιδιότητές του (Boon et al., 2010). Επιπλέον, το λυκοπένιο είναι γνωστό για τη μείωση του κινδύνου αδενώματος, και την προώθηση λειτουργικότητας του ανοσοποιητικού συστήματος (Kun et al., 2006). Συνιστάται, 6-15 mg πρόσληψη λυκοπενίου για την βελτίωση της υγείας (Kun et al., 2006). Οι διαλυτές φυτικές ίνες ρυθμίζουν τη γλυκόζη στο αίμα και τα επίπεδα χοληστερόλης (Weickert and Pfeifer, 2008). Ενώ οι αδιάλυτες φυτικές ίνες προάγουν την κάθαρση και βοηθούν εναντίον πολλών καρκίνων όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου (Alvarado et al., 2001). Στα προϊόντα τομάτας, η βιταμίνη C και οι πολυφαινόλες έχουν αναφερθεί ότι είναι τα κύρια υδρόφιλα αντιοξειδωτικά συστατικά, ενώ η βιταμίνη Ε και τα καροτενοειδή αποτελούν κυρίως το υδρόφοβο κλάσμα (Hsu, 2008). Πολλές επιδημιολογικές μελέτες έχουν συσχετίσει την κατανάλωση φρούτων και λαχανικών με τον προστατευτικό ρόλο τους ενάντια σε πολλές ασθένειες (Hannum, 2004). Ρίζες οξυγόνου, μπορεί να αντιδράσουν με λίπη, πρωτεΐνες και DNA. Ο ρόλος των αντιοξειδωτικών που υπάρχουν στα φρούτα και στα λαχανικά είναι να διατηρούν τα χαμηλά επίπεδα των ελευθέρων ριζών είτε παρεμποδίζοντας την εμφάνισή τους, είτε ευνοώντας την αποσύνθεσή τους (Hancock et al., 2007). Παρόλα αυτά, το τελευταίο διάστημα, λόγω του αυξανόμενου αριθμού τροφιμογενών ασθενειών σε όλο τον κόσμο, επικρατεί ανησυχία σχετικά με την μικροβιολογική ασφάλεια των τροφίμων αυτών. Τρόφιμα «έτοιμα προς κατανάλωση (ready-to-eat)», θεωρούνται ότι ανήκουν στην κατηγορία «υψηλού κινδύνου». Τα συγκεκριμένα τρόφιμα δεν επιδέχονται κάποια θερμική ή άλλη επεξεργασία θανάτωσης παθογόνων μικροοργανισμών. Η μικροβιολογική ασφάλεια των τροφίμων και των τροφιμογενών ασθενειών αποτελούν περίπλοκα ζητήματα, καθώς περισσότερες από 200 γνωστές ασθένειες είναι γνωστό ότι μεταδίδονται μέσω των τροφίμων. Οι κύριοι λόγοι μετάδοσης τροφιμογενών ασθενειών είναι η επιμόλυνση με βακτήρια, ιούς, παράσιτα, μύκητες. Στις Η.Π.Α, το μέσο ετήσιο κόστος που σχετίζεται με βακτηριακές και παρασιτικές τροφιμογενείς λοιμώξεις εκτιμάται στα 6.5 δισεκατομμύρια δολάρια (Buzby & Roberts, 1996, Tauxe, 2002). Ο Tauxe (2002) αναφέρει ότι ανάμεσα στις καταγεγραμμένες τροφιμογενείς λοιμώξεις, οι βακτηριακές λοιμώξεις ευθύνονται για ένα περίπου 30% των περιπτώσεων, οι ιολογικές για το 67% και οι παρασιτικές για το 3%. Νοσηλεία στο νοσοκομείο πραγματοποιήθηκε λόγω λοιμώξεων από βακτήρια (60%), από ιούς (35%) και από παράσιτα (5%). Τέλος, θάνατος είναι δυνατό να προέλθει από βακτήρια (72%), ιούς (7%) και παράσιτα (21%). Έχει αναφερθεί ότι πέντε τροφιμογενείς παθογόνοι μκροοργανισμοί (E.coli O157:H7, Salmonella, Campylobacter, Listeria, and Toxoplasma) είναι υπεύθυνοι για 3.5 εκατομμύρια κρούσματα, 33.000 νοσηλείες και 1.600 θανάτους ετησίως στις Η.Π.Α (Tauxe, 2002). Μέχρι σήμερα στις βιομηχανίες τροφίμων εφαρμόζονται μία σειρά αυστηρών πρακτικών απολύμανσης για τον έλεγχο της ασφάλειας των έτοιμων προς κατανάλωση τροφίμων. Οι πρακτικές αυτές περιλαμβάνουν ξεπλύματα με τρεχούμενο νερό ή με αντιμικροβιακά διαλύματα. Επιστημονικές μελέτες όμως καταδεικνύουν την ανικανότητα επαρκούς απολύμανσης παθογόνων μικροοργανισμών που υπάρχουν στα τρόφιμα, με τις συνήθεις πρακτικές που εφαρμόζονται σήμερα. Για το λόγο αυτό, νέες τεχνικές πολλαπλών εμποδίων έχουν αρχίσει να εφαρμόζονται με σκοπό την διασφάλιση της δημόσιας υγείας. Τα τρόφιμα επεξεργάζονται με διάφορες τεχνολογίες με σκοπό την μείωση και την απομάκρυνση πιθανών παθογόνων ή άλλων βιολογικών κινδύνων που μπορεί να υπάρχουν στα τρόφιμα. Οι κλασικές τεχνολογίες απολύμανσης όπως παστερίωση ή αποστείρωση, χρησιμοποιούνται με σκοπό την απενεργοποίηση ή τη θανάτωση των μικροβίων. Η απολύμανση με χλώριο αποτελεί μία ευρέως διαδεδομένη και οικονομική μέθοδο απολύμανσης η οποία χρησιμοποιείται για την απολύμανση νερού και τροφίμων (EPA, 1999c). Διαφορετικές μορφές χλωρίου μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην απολύμανση των τροφίμων όπως: διοξείδιο του χλωρίου, υποχλωριώδες νάτριο, υποχλωριώδες ασβέστιο, κ.α (Park et al., 2008). Παρόλα αυτά το χλώριο μπορεί να αντιδράσει με οργανικές ουσίες σχηματίζοντας έτσι τοξικές χημικές ουσίες όπως οργανοχλωρoπαράγωγα, δηλαδή ενώσεις που ανήκουν στην κατηγορία των τριαλογονοµεθανίων (THM’s) (McDonnel and Russell, 1999). Οι εναλλακτικές, μη-θερμικές τεχνολογίες απολύμανσης έχουν αποδειχθεί ότι είναι ικανές να επιτύχουν απολύμανση μικροβίων χωρίς την έκθεση των τροφίμων σε θερμότητα. Έχει επίσης βρεθεί ότι οι τεχνολογίες αυτές διατηρούν τα διατροφικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων, επεκτείνοντας τον χρόνο ζωής τους και διατηρώντας την εξωτερική τους εμφάνιση (Butz and Tauscher, 2002). Τέτοιες τεχνολογίες είναι τα παλλόμενα ηλεκτρικά πεδία (PEF), η υπεριώδης ακτινοβολία (UV), το παλλόμενο φως υψηλής έντασης (HILP), υπέρηχοι (US), εγγύς υπεριώδης φως (NUV light), ιονίζουσα ακτινοβολία, όζων, υψηλή υδροστατική πίεση (HPP)κ.α (Mohd. Adzahan and Benchamaporn, 2007). Η ακτινοβολία στο εγγύς υπεριώδες 395± 5 nm, δρα διεγείροντας ενδογενή μόρια πορφυρίνης παράγοντας μονήρες οξυγόνο (1O2), που καταστρέφει τα κύτταρα και έτσι θανατώνονται οι μικροοργανισμοί (Elman and J. Lebzelter, 2004, Feuerstein et al. 2005, Maclean et al. 2008b, Murdoch et al., 2012, Lipovsky et al. 2010). Η υπεριώδης ακτινοβολία όταν διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη των μικροοργανισμών και απορροφάται από τα κυτταρικά συστατικά τους (DNA, RNA), τους καθιστά ανίκανους να πολλαπλασιαστούν. Το κατάλληλο μήκος κύματος το οποίο μπορεί να προκαλέσει ζημιά στο μικροβιακό DNA ή RNA είναι περίπου 254 nm. Όταν το γενετικό υλικό των κυττάρων απορροφά την ενέργεια από την υπεριώδη ακτινοβολία σχηματίζονται διμερή πυριμιδίνης μεταξύ γενετικών βάσεων πυριμιδίνης στην ίδια αλυσίδα DNA. Χάρη σε αυτό το δεσμό διμερών στην αλυσίδα του DNA, οι μικροοργανισμοί προσβάλλονται με τέτοιο τρόπο ώστε ο διαχωρισμός των κυττάρων και επομένως ο πολλαπλασιασμός τους να είναι αδύνατος. Έτσι, ο μικροοργανισμός γίνεται αβλαβής και θανατώνεται (Guerrero- Beltrán and Barbosa-Cánovas, 2004). Αν και οι περισσότεροι μικροοργανισμοί προσβάλλονται από την υπεριώδη ακτινοβολία, η ευαισθησία τους ποικίλλει, καθώς εξαρτάται από την αντίσταση στη διείσδυση της υπεριώδους ακτινοβολίας. Η χημική σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος και το πάχος του καθορίζουν την αντίσταση των μικροοργανισμών στην υπεριώδη ακτινοβολία. Η αποτελεσματικότητα της απολύμανσης με υπεριώδη ακτινοβολία επηρεάζεται από την ποσότητα – δόση της υπεριώδους ενέργειας που απορροφάται από το μικροοργανισμό. Η δόση της ακτινοβολίας εξαρτάται από την ένταση της παρεχόμενης ακτινοβολίας (ενέργεια, mW), τον χρόνο κατά τον οποίο ο μικροοργανισμός εκτίθεται σε αυτήν (διάρκεια ακτινοβολίας, sec) και είναι αντιστρόφως ανάλογη με την επιφάνεια του υγρού στο οποίο εφαρμόζεται (cm2). Το παλλόμενο φως υψηλής έντασης (HILP) αποτελεί μία αναδυόμενη μη-θερμική τεχνολογία απολύμανσης, η οποία χρησιμοποιεί μικρής διάρκειας (100–400 𝜇s) αλλά υψηλής έντασης φως (200–1100 nm) (Marquenie et al., 2003, Woodling and Moraru, 2007, Gomez-Lopez et al., 2007). Ο τρόπος δράσης βασίζεται στην φωτοχημική δράση της υπεριώδους ακτινοβολίας η οποία προκαλεί διμερισμό της θυμίνης οδηγώντας στον θάνατο των κυττάρων (Muňoz et al., 2012, Gomez-Lopez et al., 2007, Rajkovic et al., 2010). Εξ’ ορισμού οι υπέρηχοι συνιστούν κύματα υψηλής συχνότητας που μεταφέρουν πίεση κατά τη διέλευσή τους σε ένα μέσο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία περιοχών χαμηλής και υψηλής πίεσης. Η διακύμανση αυτή της πίεσης αναφέρεται ως πλάτος πίεσης (amplitude) και είναι ανάλογο της ποσότητας ενέργειας που εφαρμόζεται στο σύστημα. Στην περίπτωση που οι διακυμάνσεις της πίεσης είναι αρκετά υψηλές (3.000 ΜΡa), τότε ένα υγρό μέσο μπορεί να αποδομηθεί και να έχουμε το σχηματισμό μικροφυσαλίδων αερίου και ατμού. Το φαινόμενο αυτό είναι γνωστό ως σπηλαίωση (cavitation), ενώ οι φυσαλίδες είναι δυνατόν να διασπώνται και να επαναδημιουργούνται συνεχώς επιφέροντας αλλαγές στη δομή του μέσου που υφίσταται την επίδραση των υπερηχητικών κυμάτων, απενεργοποιώντας έτσι τους μικροοργανισμούς από την επιφάνεια των τροφίμων (Bilek and Turantas, 2013). Το κύριο πλεονέκτημα των υπερήχων για τη βιομηχανία τροφίμων είναι ότι θεωρούνται μια ευρέως αποδεκτή τεχνολογία από το ευρύ καταναλωτικό κοινό, λόγω της ασφάλειάς τους, της μη τοξικότητάς τους και της φιλικότητάς τους προς το περιβάλλον. Σκοπός της παρούσας εργασίας Πολλές επιδημίες που προέρχονται από τροφιμογενείς λοιμώξεις έχουν καταγραφεί τον τελευταίο καιρό, καθώς επίσης πολλές ανακλήσεις προϊόντων συμβαίνουν. Αποτελεί λοιπόν αναγκαιότητα η εξάλειψη των παθογόνων από τρόφιμα λόγω του υψηλού κινδύνου, του υψηλού ποσοστού θνησιμότητας καθώς και της οικονομικής επιβάρυνσης που προκαλούν οι ασθένειες (π.χ λιστερίωση, σαλμονέλλωση). Στην παρούσα μελέτη μη-θερμικές, εναλλακτικές τεχνολογίες απολύμανσης ελέγχθηκαν όπως: Φως κοντά στην υπεριώδη ακτινοβολία σε μήκος κύματος 395±5 nm (NUV-Vis light), συνεχής υπεριώδης ακτινοβολία σε μήκος κύματος 254nm (Continuous UV light), υψηλής έντασης παλμοί φωτός (HILP), υπέρηχοι (ultrasound). Επίσης, η συμβατική και κλασική μέθοδος της εμβάπτισης σε υποχλωριώδες νάτριο (sodium hypochlorite solution) εφαρμόστηκε. Τέλος, συνδυασμοί εναλλακτικών, καθώς και εναλλακτικών με κλασικές μεθόδους πραγματοποιήθηκαν. Ο σκοπός ήταν ο έλεγχος της εφαρμογής των τεχνολογιών αυτών στα τρόφιμα με σκοπό τη διασφάλιση της δημόσιας υγείας των καταναλωτών. Όλες οι παραπάνω μέθοδοι εφαρμόστηκαν σε τρόφιμα έτοιμα προς κατανάλωση όπως μαρούλι, φράουλες και τοματίνια τύπου cherry, τα οποία αγοράστηκαν από τοπικό σουπερμάρκετ και εμβολιάστηκαν με παθογόνους μικροοργανισμούς οι οποίοι αποτέλεσαν το αρχικό μικροβιακό φορτίο. Οι μικροοργανισμοί οι οποίοι εμβολιάστηκαν ήταν βακτήρια που έχουν συναντηθεί στα εν λόγω τρόφιμα όπως E. coli, S. aureus, S. enteritidis και L. innocua καθώς και ο αδενοιός (HAdV35). Πιο συγκεκριμένα τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: E. coli K12, E. coli NCTC 9001 (ως μικροοργανισμοί δείκτες για το εντεροαιμοραγικό παθογόνο E. coli O157:H7), S. aureus NCTC 6571, L. innocua NCTC 11288 (ως μικροοργανισμοί δείκτες για το παθογόνο Listeria monocytogenes), S. Enteritidis NCTC 6676 και HAdV (ιός δείκτης για τους ιούς HAV και norovirus). Πιο συγκεκριμένα, στο πρώτο μέρος της διατριβής, τρεις τεχνολογίες απολύμανσης (NUV-Vis, Continuous UV, HILP) χρησιμοποιήθηκαν όσον αφορά την απολύμανση των μικροοργανισμών δεικτών (E. coli και L. innocua), τα οποία εμβολιάστηκαν σε υγρά διαλύματα (MRD Buffer). Ο σκοπός ήταν να ελεγχθεί η απολυμαντική δράση των τεχνολογιών αυτών, χρησιμοποιώντας διαφορετικές εντάσεις φωτός. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, τα τρόφιμα εμβολιάστηκαν με διάφορα βακτήρια (E. coli, S. aureus, S. Εnteritidis, L. innocua) και έναν αδενοϊό με σκοπό να ελεγχθεί η απολύμανσή τους, έπειτα από τη χρήση του χλωρίου, του υπεριώδους φωτός και των υπερήχων, καθώς επίσης και συνδυασμών τους. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις βακτηρίων, με σκοπό τον περεταίρω έλεγχο της απολυμαντικής δράσης των παραπάνω τεχνολογιών. Τέλος, τα αποτελέσματα της συγκέντρωσης των ιών που προήλθαν από τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Real-Time PCR), επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση καλλιεργειών κυττάρων. Τέλος, έπειτα από την επεξεργασία των τροφίμων με τις μεθόδους απολύμανσης, αποθηκεύτηκαν τα τρόφιμα στο ψυγείο για διάστημα 15 ημερών, και ελέγχθηκε το μικροβιακό τους φορτίο έπειτα από 3, 7 και 15 ημέρες. Στο τρίτο μέρος της διατριβής, η επίδραση των παραπάνω μεθόδων σε επιλεγμένες διατροφικές παραμέτρους και παραμέτρους ποιότητας μελετήθηκε. Για το σκοπό αυτό, ελέγχθηκαν πριν και έπειτα από την χρήση των τεχνολογιών: η ολική αντιοξειδωτική τους ικανότητα, η περιεκτικότητά τους σε ολικά φαινολικά, η συγκέντρωση ασκορβικού οξέος και η ένταση του χρώματός τους. Στο τέταρτο μέρος της διατριβής, χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο πρόβλεψης για την ασφάλεια των τροφίμων. Το μοντέλο αποτελεί ένα μοντέλο λήψης απόφασης το οποίο χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή με σκοπό την λήψη απόφασης σε ένα πολύπλοκο σύστημα μιας καθετοποιημένης εταιρείας μαρουλιού. Στην συγκεκριμένη περίπτωση, 9 κρίσιμα σημεία κατά τη διάρκεια παραγωγής-επεξεργασίας και διάθεσης λαχανικών επιλέχθηκαν για το σύστημα. Τα σημεία αυτά ήταν: εργατικό δυναμικό- προσωπικό, συστήματα ποιότητας και ασφάλειας τροφίμων, τοποθεσία-περιβάλλων χώρος της μονάδας παραγωγής τροφίμων, φυτώριο μαρουλιού, έδαφος παραγωγής μαρουλιού, διαδικασία συγκομιδής, διαδικασία μετά τη συγκομιδή, μεταφορά, πώληση. Στη συνέχεια, τρεις ειδικοί βαθμολόγησαν τα 9 κριτήρια αυτά μεταξύ τους, ως προς την ύπαρξη ή απουσία σχέσης τους με σκοπό την πρόβλεψη ασφάλειας του τελικού προϊόντος. Το συγκεκριμένο μοντέλο βασίζεται στη θεωρία των ασαφών γνωστικών δικτύων. Στο τελευταίο κομμάτι της διατριβής, τα αποτελέσματα από τις μεθόδους απολύμανσης συγκεντρώθηκαν, και με βάση τη μολυσματική δόση κάθε μικροοργανισμού στο τελικό προϊόν που έχει καταγραφεί στην βιβλιογραφία, εξάχθηκαν συμπεράσματα σχετικά με την αποτελεσματικότητα των μεθόδων σε σχέση με την διασφάλιση της δημόσιας υγείας. Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα της διατριβής απέδειξαν ότι οι εναλλακτικές, μη-θερμικές τεχνολογίες απολύμανσης είναι αποδοτικές για την απενεργοποίηση των μικροοργανισμών σε φρέσκα έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα και μπορούν να εφαρμοστούν ως εναλλακτικές στην διαδεδομένη απολύμανση με τη χρήση χλωρίου. Ιδιαίτερη έμφαση αξίζει να δοθεί στα διατροφικά χαρακτηριστικά, πριν την επιλογή της τεχνολογίας απολύμανσης, έτσι ώστε να μην υποβαθμίζονται τα ευεργετικά συστατικά των τροφίμων αυτών για την ανθρώπινη υγεία. Από τις μη-θερμικές τεχνολογίες φωτός, οι παλμοί υψηλής έντασης (HILP) απενεργοποίησαν τους μικροοργανισμούς E. coli και L. innocua σε συντομότερο χρονικό διάστημα σε σύγκριση με τις άλλες δύο τεχνολογίες απολύμανσης (Continuous UV και NUV-Vis). Όταν το δείγμα τοποθετήθηκε σε μικρή απόσταση από την πηγή φωτός (2.5 cm), οι μικροοργανισμοί E. coli και L. innocua μειώθηκαν κατά 3.07 and 3.77 log10 CFU/mL αντίστοιχα μετά από χρόνο επεξεργασίας 5 δευτερόλεπτα. Έπειτα από χρόνο επεξεργασίας 30 δευτερολέπτων με την ίδια τεχνολογία και έντασης 106.2 J/cm2, οι μικροοργανισμοί ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσής τους (<0.22 log10 CFU/mL). Η επεξεργασία με τη μη-θερμική τεχνολογία του υπεριώδους φωτός στο μαρούλι, μείωσε σημαντικά τους πληθυσμούς των παρακάτω μικροβίων E. coli, S.aureus, S. Enteritidis and L. innocua κατά 1.75, 1.21, 1.39 και 1.27 log10 CFU/g, αντίστοιχα. Όταν η μη-θερμική τεχνολογία των υπερήχων εφαρμόστηκε, μία λογαριθμική μείωση της τάξης των 2 log10 CFU/g για τους πληθυσμούς E. coli, S. Enteritidis και L. innocua καταγράφηκε. Η τεχνολογία υπεριώδους ακτινοβολίας μείωσε το μικροβιακό φορτίο κατά 1–1.4 log10 CFU/g. Οι μέγιστες λογαριθμικές μειώσεις που παρατηρήθηκαν στη φράουλα μετά την επεξεργασία με υπερήχους, ήταν 3.04, 2.52, 5.24 και 6.12 log10 CFU/g για τους μικροοργανισμούς E. coli, S. aureus, S. Enteritidis και L. innocua, αντίστοιχα. Τέλος, στα τοματίνια cherry, η απολύμανση με τη χρήση μη-θερμικών τεχνολογιών, είχε τα καλύτερα αποτελέσματα. Πιο συγκεκριμένα η απολύμανση με τη χρήση υπερήχων μείωσε το μικροβιακό φορτίο κατά 3.16, 2.62, 3.29, 3.16 log10 CFU/g για τους μικροοργανισμούς E. coli, S. aureus, S. Enteritidis και L. innocua, αντίστοιχα. Αξίζει να αναφερθεί ότι η τεχνολογία υπεριώδους ακτινοβολίας, είχε ως αποτέλεσμα την μείωση κατά 2.39, 2.05, 2.62, 2.56 log10 CFU/g των παραπάνω μικροοργανισμών αντίστοιχα. Στη συνέχεια εφαρμόστηκαν και στα τρία έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα συνδυασμοί των παραπάνω μη-θερμικών εναλλακτικών τεχνολογιών. Η μείωση του μικροβιακού φορτίου με τη χρήση υποχλωριώδους νατρίου 200ppm ήταν 1-2 log10 CFU/g log για το μαρούλι και τις φράουλες, ενώ μεγαλύτερες μειώσεις (3-4 log10 CFU/g) καταγράφηκαν όταν τα τοματίνια απολυμάνθηκαν με χλώριο. Τέλος, οι συνδυασμοί εναλλακτικών-συμβατικών τεχνολογιών είχαν ως αποτέλεσμα μία μείωση της τάξεως των 2-3.50 log10 CFU/g, για το μαρούλι και τις φράουλες, ενώ μείωση 3.28-4.78 log10 CFU/g πραγματοποιήθηκε για τα τοματίνια τύπου cherry. Κατά την απολύμανση του αδενοϊού, η πιο αποτελεσματική μέθοδος ανάμεσα σε όλες οι οποίες εφαρμόστηκαν, αποδείχθηκε η χρήση χλωρίου. Από τις εναλλακτικές μη-θερμικές τεχνολογίες, η χρήση υπεριώδους φωτός ήταν πιο αποδοτική σε σχέση με τους υπερήχους, μειώνοντας το ιϊκό φορτίο κατά 2.13, 1.25 και 0.92 log10 για τα μαρούλια, τις φράουλες και τα τοματίνια αντίστοιχα όταν τα τρόφιμα αυτά εκτέθηκαν σε υπεριώδη ακτινοβολία για χρονικό διάστημα 30 λεπτών. Αντιθέτως η μείωση του ιϊκού φορτίου όταν εφαρμόστηκαν υπέρηχοι για 30 λεπτά ήταν 0.85, 0.53 και 0.36 log10 για τα τρία τρόφιμα αντίστοιχα. Αξίζει να αναφερθεί ότι η συνδυαστική χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας και υπερήχων ήταν πιο αποδοτική και λιγότερο χρονικά δαπανηρή, σε σχέση με τη μεμονωμένη χρήση των δύο παραπάνω τεχνολογιών, όσον αφορά την απολύμανση των τροφίμων από βακτήρια και ιούς, αποδεικνύοντας την αθροιστική τους δράση. Όσον αφορά τις παραμέτρους ποιότητας των τροφίμων, η χρήση εναλλακτικών τεχνολογιών απολύμανσης (UV, US) για χρονικό διάστημα μικρότερο των 30 λεπτών, δεν άλλαξε σημαντικά (p>0.05) το χρώμα των τροφίμων. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p>0.05) στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα των τροφίμων όταν χρησιμοποιήθηκε η συμβατική τεχνολογία απολύμανσης με χλώριο. Όταν οι εναλλακτικές τεχνολογίες χρησιμοποιήθηκαν, μία αύξηση στην συγκέντρωση των ολικών αντιοξειδωτικών ήταν εμφανής από τα πρώτα λεπτά της απολύμανσης. Η περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά παρέμεινε σταθερή ή μειώθηκε ελαφρώς όταν τα τρόφιμα απολυμάνθηκαν με την χρήση χλωρίου. Αντιθέτως, όταν τα τρόφιμα απολυμάνθηκαν με τις εναλλακτικές τεχνολογίες απολύμανσης η περιεκτικότητά τους σε φαινολικά συστατικά αυξήθηκε σημαντικά (p<0.05). Τέλος, η περιεκτικότητα σε βιταμίνη C δεν μεταβλήθηκε κατά τη διάρκεια των διαφόρων τεχνολογιών. Όταν ο χρόνος απολύμανσης με τις διάφορες τεχνολογίες ξεπέρασε τα 30 λεπτά ή όταν συνδυάστηκαν οι εναλλακτικές τεχνολογίες μεταξύ τους για συνολικό διάστημα 30 λεπτών, σημαντική μείωση της περιεκτικότητας της βιταμίνης C παρατηρήθηκε (p<0.05). Το υπολογιστικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε βασίστηκε σε κρίσιμα σημεία τα οποία θεωρούνται σημαντικά σε μια καθετοποιημένη μονάδα παραγωγής μαρουλιών. Πιο συγκεκριμένα, αναπτύχθηκε ένα σύστημα λήψης απόφασης με τη χρήση των ασαφών γνωστικών δικτύων. Ο σκοπός ήταν η διάγνωση και ο έλεγχος των κρίσιμων σημείων ελέγχου σε μία παραγωγική μονάδα, έτσι ώστε να διασφαλιστεί η υγιεινή και η ασφάλεια των τροφίμων. Η μεθοδολογία που εφαρμόστηκε, χρησιμοποιεί την αληθινή γνώση και εμπειρία ειδικευμένων στην παραγωγική διαδικασία της παραγωγής των μαρουλιών. Αποδείχθηκε ότι η χρήση ενός τέτοιου μοντέλου μπορεί να προβλέψει και να αποτρέψει προβλήματα που μπορεί να συμβούν κατά τη διάρκεια της παραγωγικής διαδικασίας, έτσι ώστε να διασφαλιστεί η υγεία και η ασφάλεια των καταναλωτών. Το μοντέλο λήψης απόφασης εφαρμόστηκε σε τρεις διαφορετικές περιπτώσεις της ίδιας μονάδας παραγωγής μαρουλιών, όπου εξάχθηκαν αποτελέσματα σχετικά με την ασφάλεια του τελικού προϊόντος. Στο τελευταίο μέρος των αποτελεσμάτων της διατριβής, βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τη μολυσματικότητα των παραπάνω βακτηρίων και ιών συλλέχθηκαν από διάφορους φορείς (FDA, PHAC, European pathogen fact sheet). Στη συνέχεια, με βάση τα αποτελέσματα των μεθόδων απολύμανσης που εφαρμόστηκαν στα τρόφιμα, συμπεράσματα εξήχθηκαν για την ικανότητα των μεθόδων αυτών να εφαρμοστούν στα τρόφιμα και να διασφαλίσουν την δημόσια υγεία. Έτσι στο μαρούλι, παρατηρήθηκε ότι η συνδυαστική τεχνολογία των υπερήχων ακολουθούμενη από χλώριο αποτέλεσε την καλύτερη τεχνολογία απολύμανσης των βακτηρίων, ενώ η υπεριώδης ακτινοβολία και το χλώριο είναι αποτελεσματικές τεχνολογίες για την απολύμανση των ιών. Για τις φράουλες, οι υπέρηχοι, και η συνδυαστική τεχνολογία US+NaOCl, ήταν ικανές να απολυμάνουν επαρκώς τα βακτήρια, ενώ η υπεριώδης ακτινοβολία αποδείχθηκε ως η πιο αποτελεσματική τεχνολογία για την απολύμανση του αδενοιού στη φράουλα. Στα τοματίνια τύπου cherry σχεδόν όλες οι τεχνολογίες ήταν ικανές να τα απολυμάνουν ικανοποιητικά. Η συνδυαστική τεχνολογία US+NaOCl αποδείχθηκε αποδοτική για την απολύμανση των βακτηρίων ενώ το χλώριο για τους ιούς. Σε γενικές γραμμές παρατηρήθηκε ότι η επίδραση των τεχνολογιών απολύμανσης εξαρτάται από την τεχνολογία, το χρόνο επεξεργασίας και το είδος του τροφίμου. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής απέδειξαν τις εναλλακτικές τεχνολογίες ως ικανές και φιλικές προς το περιβάλλον τεχνολογίες που μπορούν να εφαρμοστούν στα τρόφιμα με σκοπό την διασφάλιση της υγείας των καταναλωτών. Συμπεράσματα Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης απέδειξαν ότι οι εναλλακτικές, μη-θερμικές τεχνολογίες απολύμανσης, επέδρασαν σε μία αποτελεσματική μείωση του μικροβιακού πληθυσμού τόσο των υγρών διαλυμάτων όσο και των τροφίμων. Από τις εναλλακτικές τεχνολογίες φωτός, το παλλόμενο φως υψηλής έντασης αποτελεί την πιο αποδοτική μέθοδο για την απολύμανση των βακτηρίων E.coli και L.innocua. Επίσης αυτή η τεχνολογία είχε ως αποτέλεσμα την πιο γρήγορη και εντατική απολύμανση σε σχέση με τις άλλες δύο τεχνολογίες φωτός που εφαρμόστηκαν. Η εξαιρετική απόδοση της τεχνολογίας αυτής πιθανόν οφείλεται στην υψηλότερη διεισδυτική ικανότητα της συγκεκριμένης πηγής φωτός καθώς και της μεγαλύτερης ισχύος εκπομπής σε σχέση με τη συνεχή υπεριώδης ακτινοβολία και την εγγύς υπεριώδη ακτινοβολία (NUV-vis). Η υψηλή ένταση του φωτός από την τεχνολογία παλλόμενου φωτός, απέδιδε μία ένταση φωτός κατά 100 φορές μεγαλύτερη από τις άλλες τεχνολογίες, στον ίδιο χρόνο λειτουργίας. Περισσότερη μελέτη χρειάζεται να πραγματοποιηθεί σε τρόφιμα ώστε να διεξαχθούν συμπεράσματα εάν η τεχνολογία αυτή δημιουργεί παραπροϊόντα στα τρόφιμα αυτά. Μπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι η εγγύς υπεριώδη ακτινοβολία είναι μία υποσχόμενη μέθοδος για τη χρήση της σε βιομηχανίες τροφίμων, αυξάνοντας έτσι την παραγωγικότητα τους. Οι εναλλακτικές τεχνολογίες (UV, US) που εφαρμόστηκαν στην απολύμανση των τροφίμων αποτελούν εναλλακτικές στις ήδη υπάρχουσες διαδεδομένες τεχνολογίες απολύμανσης. Μπορούν δηλαδή να εφαρμοστούν από τις βιομηχανίες τροφίμων, ως τεχνολογίες χαμηλού κόστους και χαμηλής κατανάλωσης ενέργειας, καθώς δεν απαιτούν ιδιαίτερο εξοπλισμό. Η απόδοση των τεχνολογιών αυτών εξαρτάται από την δόση, τον χρόνο έκθεσης, την επιφάνεια του τροφίμου. Οι υπέρηχοι ήταν αποδοτικότερη μέθοδος για την απολύμανση των βακτηρίων, ενώ η υπεριώδης ακτινοβολία πιο αξιόπιστη για την απολύμανση των ιών. Κάποιες πιθανές μεταβολές του χρώματος των τροφίμων μπορούν να ελεγχθούν, εφόσον χρησιμοποιηθούν οι κατάλληλες συνθήκες των τεχνολογιών, διατηρώντας έτσι αναλλοίωτα τα χαρακτηριστικά των τροφίμων. Οι συνδυαστικές τεχνολογίες είναι υποσχόμενες, εφόσον επιβεβαιωθεί η απουσία παραπροϊόντων χλωρίου στα τελικά προϊόντα. Επίσης, πρέπει να σημειωθεί ότι δεν μπορεί να γίνει μία απευθείας σύγκριση τεχνολογιών απολύμανσης εάν δεν ληφθούν υπόψη και άλλες παράμετροι όπως το χρώμα και διατροφικές παράμετροι. Στην παρούσα μελέτη αποδείχθηκε ότι υπάρχει θετική ή μηδαμινή επίδραση στην ποιότητα των τροφίμων έπειτα από τις περισσότερες τεχνολογίες που εφαρμόστηκαν. Οι μικροβιολογικές και οι μοριακές αναλύσεις μπορούν να εφαρμοστούν στον ποιοτικό έλεγχο μιας διατροφικής αλυσίδας. Ωστόσο, τα αποτελέσματα των αναλύσεων αυτών είναι χρονοβόρα (μικροβιολογικές αναλύσεις) και πολλές φορές οικονομικά ασύμφορα (μοριακές αναλύσεις). Επίσης, πολλές φορές τα αποτελέσματα των αναλύσεων εξαρτώνται από την ακρίβεια καθώς και το καλιμπράρισμα του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται. Για τον σκοπό αυτό προτάθηκε και το θεωρητικό μοντέλο το οποίο μπορεί να παρέχει ένα πρώτο έλεγχο-εκτίμηση της ποιότητας του τροφίμου που παράγεται σε μία μονάδα παρασκευής-επεξεργασίας. Το μοντέλο αυτό εφαρμόστηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πρώτη φορά σε μονάδα επεξεργασίας μαρουλιών. Βασίζεται στη θεωρία των ασαφών γνωστικών δικτύων και αποτελεί μία απλή, φθηνή, φιλική, πραγματικού χρόνου και εύκολη προσέγγιση για την πιθανή εκτίμηση της ποιότητας-ασφάλειας του μαρουλιού. Επιπροσθέτως, το συγκεκριμένο μοντέλο θα μπορούσε να αξιοποιηθεί από τις Αρχές Ελέγχου Τροφίμων, με σκοπό να αποκτούν μία πρώτη εκτίμηση των προϊόντων που πρόκειται να επιθεωρήσουν. Οι τροφιμογενείς λοιμώξεις παρουσιάζουν μία διαρκώς αυξανόμενη τάση, και βασίζονται στην αυξανόμενη παραγωγή και ζήτηση τροφίμων και ιδιαίτερα έτοιμων προς κατανάλωση τροφίμων. Οι καταναλωτές αντιλαμβάνονται την ασφάλεια των τροφίμων ως «δεδομένο», και για το λόγο αυτό η βιομηχανία τροφίμων πρέπει να εξασφαλίσει την «ποιότητα» των παραγόμενων προϊόντων. Η αυξημένη ζήτηση των καταναλωτών για τα συγκεκριμένα τρόφιμα βασίζεται στην προμήθεια τροφίμων με «μηδενικό» ή «ανύπαρκτο» κίνδυνο και το κόστος για την επίτευξη του γεγονότος αυτού δεν θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη εφόσον ο στόχος παραμένει πάντα η διασφάλιση της δημόσιας υγείας. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής, οι εναλλακτικές τεχνολογίες απολύμανσης διαδραματίζουν ένα σπουδαίο ρόλο και αποτελούν βιώσιμες τεχνολογίες οι οποίες μπορούν να ενταχθούν στην καθημερινή πρακτική με σκοπό να παρεμποδίσουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών και να μειώσουν το κίνδυνο μόλυνσης, διασφαλίζοντας έτσι την δημόσια υγεία. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στην επιλογή των κατάλληλων συνθηκών των τεχνολογιών ώστε να διατηρηθούν τα απαραίτητα διατροφικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων, τα οποία έχουν ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία των καταναλωτών.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΔΔ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Birmpa(med).pdf4.52 MBAdobe PDFView/Open

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.