Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/9255
Title: Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας πολυπεπτιδικών τμημάτων της Ε3 λιγάσης ουβικιτίνης ARKADIA 2
Authors: Γιάνναρη, Δανάη Δέσποινα
Keywords: Ε3 Λιγάσες
RING τομέας
Ουβικιτινίωση
Φασματοσκοπία NMR
Arkadia 2
Keywords (translated): E3 Ligases
RING domain
Ubiquitination
NMR Spectroscopy
Arkadia 2
Abstract: Η πρωτεϊνική αποικοδόμηση επιτελείται είτε μέσω λυσοσωμικής πρωτεόλυσης είτε μέσω της ουβικιτινο-εξαρτώμενης διαδικασίας στο πρωτεάσωμα. Το μονοπάτι της ουβικιτίνης/πρωτεασώματος στο οποίο καταλήγουν πολλές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες είναι μία ζωτική λειτουργία για την ομοιόσταση του κυττάρου και κατ’ επέκταση του οργανισμού. Η μετα-μεταφραστική αυτή τροποποίηση απαιτεί τη συμμετοχή 3 τύπων ενζύμων, του Ε2 ενζύμου-εκκινητή του καταρράκτη αντιδράσεων, του Ε2 ενζύμου μεταφορέα της ουβικιτίνης και της Ε3 λιγάσης ουβικιτίνης. Ο εξέχων ρόλος των Ε3 ενζύμων διακρίνεται αφενός για το γεγονός ότι γεφυρώνει την απόσταση μεταξύ της πρωτεΐνης-στόχου και της ουβικιτίνης προκαλώντας έμμεσα τη δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού και αφετέρου για τον υψηλό βαθμό εκλεκτικότητας και εξειδίκευσης των υποστρωμάτων τους (Ε2 ένζυμο, αποικοδομητέα πρωτεΐνη). Η πρωτεΐνη Arkadia2C/RNF165 ανήκει στην κατηγορία των Ε3 λιγασών με το χαρακτηριστικό μοτίβο δέσμευσης ιόντων Zn(II) RING-H2 τύπου cross-brace το οποίο εδράζεται στο C-τελικό της άκρο. Ο καταλυτικός τομέας αποτελείται από 41 αμινοξικά κατάλοιπα με 2 κέντρα δέσμευσης των μεταλλοϊόντων και διάταξη C3H2C3. Η ενζυμική της δράση ασκείται στο βιοχημικό μονοπάτι των Μορφοτικών Πρωτεϊνών των Οστών (ΒΜΡ), ένα συγγενές μονοπάτι του TGF-β. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν 3 πολυπεπτιδικά τμήματα του καρβοξυ-τελικού άκρου της Ark2C, αυξανόμενου μεγέθους, και 2 μεταλλάγματα ενός εξ αυτών. Πιο συγκεκριμένα, αφορούν στο τμήμα αγρίου τύπου Wt του C-τελικού άκρου της RNF165 με 68aa στο οποίο εμπεριέχεται ο RING τομέας, στο C-τελικό τμήμα 110aa το οποίο διαφέρει από το Wt λόγω της επιμήκυνσης του προς το Ν-τελικό άκρο και στο Full length τμήμα μήκους 279 αμινοξέων. Τα 2 μεταλλάγματα αφορούν στην αντικατάσταση της Trp324 του Wt σε Ala (W324A) και Arg (W324R) αντίστοιχα. Όλα τα ανασυνδυασμένα τμήματα κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν με τεχνικές Μοριακής Βιολογίας ενώ για την NMR δομική μελέτη, όσων από αυτά ήταν εφικτό, επισημάνθηκαν με ενεργούς πυρήνες 13C και 15Ν μια συνθήκη αναγκαία για τη φασματοσκοπική αυτή τεχνική. Σύμφωνα με το σύνολο των φασμάτων, τα πρωτεϊνικά μόρια Wt, W324A και W324R Long είναι καλά δομημένα και αναδιπλωμένα. Οι σημειακές μεταλλάξεις δεν επηρέασαν το σχηματισμό της δευτεροταγούς δομής. Οι μετρήσεις Ατομικής Απορρόφησης επαλήθευσαν ότι ο τομέας RING του Wt δεσμεύει 2 ιόντα Zn2+ ενώ παράλληλα τα δεδομένα των τιτλοδοτήσεων με EDTA, μέσω της φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού, απέδειξαν την αναγκαιότητα της συναρμογής του ψευδαργύρου στη σταθερότητα του τομέα. Επίσης, διαφαίνεται από τις NMR μελέτες αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο UbcH5b ότι διαθέτει την ικανότητα πρόσδεσης σε αυτό, όπως συμβαίνει με το ομόλογο τμήμα της Arkadia/RNF111. Η αλληλεπίδραση του τμήματος W324R με το χηλικό παράγοντα EDTA επιβεβαίωσε τη σημασία του Zn(II) στη διαμόρφωση του μοτίβου. Ωστόσο, η παρουσία περίσσειας ZnSO4 δείχνει ότι ενδεχομένως πρόκειται για αντιστρεπτή αντίδραση καθώς το μόριο ανέκτησε την αρχική του αναδίπλωση. Το φαινόμενο αυτό, όμως, δεν επαναλήφθηκε στην περίπτωση της Wt πρωτεΐνης. Τέλος, κατά την NMR πειραματική μελέτη του πολυπεπτιδικού τμήματος 110aa φαίνεται ότι τα επιπλέον κατάλοιπα της αμινοτελικής ουράς παρουσιάζουν μια ιδιάζουσα ευκίνητη συμπεριφορά. Φαίνεται ότι ο πυρήνας του είναι δομημένος αλλά συνολικά η πρωτεΐνη δεν έχει καλή αναδίπλωση. Η μελέτη της Full length πρωτεΐνης κρίθηκε περιορισμένη εξαιτίας του σχηματισμού έγκλειστων σωματίων.
Abstract (translated): Intracellular protein degradation is mediated either by lysosomal proteolysis or by a ubiquitin-dependent process that targets unwanted proteins to proteasome. The ubiquitin/proteasome pathway in which many proteins result, is of vital importance for cellular homeostasis and hence for the organism itself. This post-translational modification requires the participation of three types of enzymes, E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 conjugating enzyme and E3 ubiquitin ligase. The prominent role of E3 ligases is distinguished by the fact that it bridges the distance between the target protein and ubiquitin and thus mediating in covalent bonding; on the other hand, they are discerned for their high degree of specificity and selectivity concerning their substrates (E2 enzyme, target protein). Arkadia 2C/RNF165 protein belongs to the class of E3 ligases with a distinct zinc ion motif located at the C-terminal region. The RING finger domain is consisted of 41 amino acids and binds two Zn2+ in a unique “cross-brace” arrangement through a defined motif of 6 cysteine and 2 histidine residues (C3H2C3). Arkadia 2C is identified as a positive regulator of Bone Morphogenetic Proteins (BMP) signalling, a TGF-β related pathway. The present work is focused on the study of 3 polypeptide contructs of Ark2C’s C-terminal region, of increasing molecular weight, and 2 mutants. More specifically, the above are: a recombinant protein of 68 aa (Wt) containing, at the C-terminus, the wild type RING domain, a longer polypeptide construct of 110aa which differs from Wt due to its extension towards N-terminus and a Full length protein which has a longer N-terminus length (279aa). As far as the two mutants are concerned, we transformed Wt to a nonnative sequence substituting Trp324 residue to Ala (W324A) and Arg (W324R) respectively. All recombinants were cloned and expressed via molecular biology techniques as well as they were uniformly labeled in 15N and 13C nuclei in order to proceed in NMR-based structural analysis, only for those that it was feasible to carry out the relevant experiments. According to the total of the NMR spectra, the protein molecules Wt, W324A and W324R demonstrated a proper structure and well folding. Point mutations did not affect the formation of the secondary structure. Furthermore, the Atomic Absorption measurements verified that Wt RING domain binds two Zn2+ while the data of EDTA chelation corroborated to the necessity of zinc coordination in order to assure stability. In addition, it comes into sight that Wt is able to interact with the E2 partner UbcH5b, a result which is in accordance with Arkadia’s Wt homologue. What is more, when W324R was chelated by EDTA agent led to a loss of the chemical characteristics of the folded proteins, confirming once again the importance of zinc. Nevertheless, the protein was reversibly refolded upon addition of excess ZnSO4 indicated by the re-appearance of a spectrum that was identical to that before addition. Possibly, it comes out to be a reversible reaction, however, this phenomenon was not repeatable in the case of Wt. Finally, based on NMR data it is deduced that the 110aa extra N-terminal tail exhibits a flexible behavior. It seems that the core region is well structured but the protein as a whole is not folded. Studying Full length construct was limited because of the formation of inclusion bodies.
Appears in Collections:Τμήμα Φαρμακευτικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
DGiannari.pdf5.65 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.