Παπαδέα, ΠολυξένηPapadea, Polyxeni2023-10-202023-10-202023-10https://hdl.handle.net/10889/26008Η παρούσα διδακτορική διατριβή οδήγησε στην ανάπτυξη απλών και καινοτόμων μεθοδολογιών για την απομόνωση, το χαρακτηρισμό και την κλασμάτωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL) στα κύρια μοριακά τους συστατικά. Απώτερος σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη σε αυτά συγκεκριμένων οξειδωτικών τροποποιήσεων οι οποίες χαρακτηρίζουν τα, αιτιακώς σχετιζόμενα με την ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών και άρα και με τον κίνδυνο εμφάνισης των επακόλουθων καρδιαγγειακών παθήσεων , οξειδωμένα LDL (oxLDL) σωματίδια. Οι αναπτυχθείσες στην παρούσα διατριβή μέθοδοι περιλαμβάνουν: (α) Μία απλή, σχετικά γρήγορη και χαμηλού κόστους μέθοδο για την απομόνωση των LDL σωματιδίων (LDL-P) από τον ορό του αίματος, προς αποφυγή των μειονεκτημάτων των έως τώρα εφαρμοζόμενων υπερφυγοκεντρικών μεθόδων και μεθόδων χρωματογραφίας συγγένειας. (β) Επιβεβαίωση της καθαρότητας των απομονωμένων με την προτεινόμενη μεθοδολογία LDL, μέσω SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης της πρωτεΐνης αυτών (απολιποπρωτεΐνη Β100, apoB100), και προσδιορισμός του μεγέθους των LDL-P. Το τελευταίο καθώς και η συγκέντρωση των LDL-P στον ορό υπολογίζονται στην παρούσα διατριβή μέσω μίας αναπτυχθείσας απλής, κλινικά εφαρμόσιμης μεθόδου - σε σύγκριση με τις υπάρχουσες μεθοδολογίες μαγνητικού πυρηνικού συντονισμού (NMR) – ενώ αξιολογείται και η αξία τους ως δείκτες εκτίμησης του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών παθήσεων. (γ) Μία μέθοδος για την κλασμάτωση των LDL, για πρώτη φορά, στα επιμέρους πρωτεϊνικά/λιπιδικά (apoB100, εστέρες χοληστερίνης, τριγλυκερίδια, ελεύθερη χοληστερίνη, φωσφολιπίδια) και αντιοξειδωτικά (καροτενοειδή, τοκοφερόλες) συστατικά τους. (δ) Μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση, για πρώτη φορά, ορισμένων συγκεκριμένων - αντιπροσωπευτικών των αρχικών επιδράσεων του οξειδωτικούς στρες - οξειδωτικών τροποποιήσεων/δεικτών στα μοριακά συστατικά των LDL (cholesteryl ester-OOH, triglyceride-OOH, free cholesterol-OOH, phospholipid-OOH, apoB100-MDA, apoB100-DiTyr) εκ των πολλών (γνωστών/άγνωστων/υπό ανάπτυξη) οξειδωτικών τροποποιήσεων που συλλογικά χαρακτηρίζουν την οξειδωτική κατάσταση των oxLDL. Οι μέθοδοι αυτοί έρχονται σε αντίθεση με τις υπάρχουσες μη-εξειδικευμένες και αναξιόπιστες μεθόδους για την αξιολόγηση της οξειδωτικής κατάστασης των oxLDL. Οι προαναφερθέντες oxLDL δείκτες μελετώνται για πρώτη φορά σε ασθενείς επιρρεπείς στην εμφάνιση και σε ασθενείς με εγκατεστημένες αθηρωματικές πλάκες και καρδιαγγειακές νόσους. Συγκεκριμένα, οι ομάδες ασθενών που επιλέχθηκαν είναι: ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο υπό αιμοκάθαρση, ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο υπό περιτοναϊκή κάθαρση, ασθενείς με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής και ασθενείς με στένωση καρωτίδων. Επιπροσθέτως, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε δομική μελέτη της apoB100 των LDL σωματιδίων, καθώς αυτή αποτελεί μέχρι και σήμερα μία πρωτεΐνη ελάχιστα μελετημένη και με άγνωστη δομή. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός των βιοφυσικών ιδιοτήτων του διαλύματος της apoB100 μέσω μελέτης της δευτεροταγούς της δομής (με ανάλυση κυκλικού διχρωισμού, CD analysis), της θερμικής της σταθερότητας (με διαφορική φθορισμομετρία σάρωσης, nanoDSF) και της ύπαρξης συσσωματωμάτων στο διάλυμα αυτής (μέσω δυναμικής σκέδασης φωτός, DLS). Έπειτα, ακολούθησαν δοκιμές LCP (Liquid Cubic Phase) κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης και μέτρηση των προκύψαντων κρυστάλλων με περίθλαση ακτίνων Χ. Συνοψίζοντας, η απομόνωση των LDL σωματιδίων και η κλασμάτωσή τους στα επιμέρους πρωτεϊνικά, λιπιδικά και αντιοξειδωτικά συστατικά τους ανοίγει το δρόμο για μελλοντικές μελέτες διερεύνησης και ποσοτικοποίησης όλων των πιθανών οξειδωτικών τροποποιήσεων των LDL και συνεπώς του πλήρους χαρακτηρισμού της, άγνωστης μέχρι σήμερα, οξειδωτικής κατάστασης των oxLDL σωματιδίων. Το γεγονός αυτό μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω μελέτες ταυτοποίησης των οξειδωτικών τροποποιήσεων των oxLDL οι οποίες αναγνωρίζονται από τα μακροφάγα και είναι υπεύθυνες για τη μετατροπή των τελευταίων σε αφρώδη κύτταρα, τα οποία ευθύνονται για το σχηματισμό των αθηρωματικών πλακών που με τη σειρά τους οδηγούν στην εμφάνιση των καρδιαγγειακών παθήσεων. Τέλος, ο βιοφυσικός χαρακτηρισμός και οι δοκιμές LCP κρυστάλλωσης της apoB100, που πραγματοποιήθηκαν για πρώτη φορά στην υπάρχουσα βιβλιογραφία στην παρούσα διατριβή, αποτελούν το έναυσμα για την πραγματοποίηση περαιτέρω μελετών κρυστάλλωσης της apoB100 με στόχο την επίλυση της, άγνωστης μέχρι σήμερα, δομής αυτής και της διαλεύκανσης της λειτουργίας και του ρόλου της στην ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών.elAttribution-NoDerivs 3.0 United StatesΟξειδωτικό στρεςΔομική βιοχημείαΑθηροσκλήρωσηOxidative stressStructural biochemistryAtherosclerosis