Κρυσταλλογραφική μελέτη ημικυτταρινασών μυκητιακής προέλευσης
Loading...
Date
2026-10-07
Authors
Ζησιμάτος, Διονύσιος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η αξιοποίηση μυκητιακών ενζύμων για την αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας και των πλαστικών, αποτελεί βασικό άξονα της σύγχρονης βιοοικονομίας. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκαν δύο ένζυμα μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ, εστιάζοντας στην κατανόηση της τρισδιάστατης δομής τους και τη συσχέτιση της δομής με τον καταλυτικό μηχανισμό.
Το πρώτο ένζυμο είναι μια νέα αμιδάση από τον μύκητα Fusarium oxysporum που ταυτοποιήθηκε μέσω ομικών μελετών πάνω σε υπόστρωμα Impranil DLN και πιθανώς σχετίζεται με τη διαδικασία αποικοδόμησης της πολυουρεθάνης. Παράλληλα, το δεύτερο ένζυμο είναι το διπλά τροποποιημένο TtCE16B_S19A_H302F, ένα καταλυτικά ανενεργό παράγωγο της εξω-αποακετυλάσης TtCE16B από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophila, το οποίο παράχθηκε για τον προσδιορισμό της δομής του συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος και κατατάσσεται στην οικογένεια CE16 των εστερασών υδατανθράκων (Carbohydrate Esterase family 16) της βάσης δεδομένων CAZy. Και τα δύο ένζυμα είναι υδρολυτικά, δηλαδή λειτουργούν παρουσία νερού, καταλύοντας τη διάσπαση αμιδικών και εστερικών δεσμών, αντίστοιχα. Όσον αφορά τον ρόλο τους, τα δύο ένζυμα δρουν σε διαφορετικά υποστρώματα, με την TtCE16B_S19A_H302F να συμμετέχει στην αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης μέσω της επιλεκτικής αφαίρεσης ακετυλομάδων από τα μη αναγωγικά άκρα ξυλοολιγοσακχαριτών, ενώ η αμιδάση, με βάση την υποθετική της δράση, αναμένεται να καταλύει την υδρόλυση των αμιδικών δεσμών του σκληρού τμήματος της πολυουρεθάνης.
Για τον δομικό προσδιορισμό των ενζύμων, εφαρμόστηκε η διαδικασία κρυστάλλωσης πρωτεϊνών με την τεχνική διάχυσης ατμών, με τη μέθοδο της καθήμενης σταγόνας για τη δημιουργία μονοκρυστάλλων. Έγιναν δοκιμές βελτιστοποίησης των συνθηκών κρυστάλλωσης, δοκιμές συγκυστάλλωσης και επώασης των ενζύμων με διάφορα υποστρώματα προκειμένου να μελετηθεί το ενεργό κέντρο και ο μηχανισμός δράσης τους. Για την TtCE16B_S19A_H302F έγιναν πειράματα με ακετυλιωμένα ολιγομερή της ημικυτταρίνης, ενώ για την αμιδάση έγιναν πειράματα με διάφορα ολιγομερή της πολυουρεθάνης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η συλλογή και η ακτινοβόληση των κρυστάλλων με ακτίνες Χ υπό κρυογονικές συνθήκες στον ερευνητικό σταθμό BioMAX του MAX IV Laboratory στο Λούντ της Σουηδίας, ώστε να προσδιοριστούν οι τρισδιάστατες δομές των δύο ενζύμων.
Η περίθλαση ακτίνων Χ παρείχε δεδομένα υψηλής ευκρίνειας, έως και 1.0 Å για την αμιδάση, επιτρέποντας την επίλυση της κρυσταλλικής δομής και την αποκάλυψη της υποθετικής καταλυτικής τριάδας τριών ιστιδινών. Επίσης, στην περίπτωση της TtCE16B_S19A_H302F, η κρυσταλλική δομή της επιλύθηκε και συγκρίθηκε με τη δομή του φυσικού τύπου TtCE16B (PDB ID: 7ZTN) και του μονού μεταλλάγματος TtCE16B_S19A (PDB ID: 8P1G), αποκαλύπτοντας τις τοπικές μεταβολές στο ενεργό κέντρο που προκύπτουν από τις δύο μεταλλάξεις. Τέλος, από τις δοκιμές συγκρυστάλλωσης και επώασης με προσδέτες δεν εντοπίστηκε κάποια ηλεκτρονιακή πυκνότητα στο ενεργό κέντρο του ενζύμου αντιπροσωπευτική των προσδετών που χρησιμοποιήθηκαν.
Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η κρυστάλλωση των ανωτέρω ενζύμων, η βελτιστοποίηση των συνθηκών κρυστάλλωσης και η βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης τους μέσω της επίλυσης της μοριακής τους δομής. Η ανάλυση των κρυσταλλικών δομών τους αποσκοπεί στην αποσαφήνιση των μηχανισμών αλληλεπίδρασης με τα υποστρώματά τους, συμβάλλοντας στη μελλοντική βελτιστοποίηση της ενζυμικής τους δράσης, τόσο στο πεδίο αξιοποίησης της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας όσο και στο πεδίο της ενζυμικής αποικοδόμησης συνθετικών πολυμερών.
Description
Keywords
Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, Ακετυλ-εστεράση, Αμιδάση, Πολυουρεθάνη, Βιοκατάλυση, Λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα