Παραγωγή και χαρακτηρισμός ανασυνδυασμένων οξειδωτικών ενζύμων με εφαρμογή στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας
Loading...
Date
2026-10-07
Authors
Μαρκόπουλος, Ευάγγελος Μάριος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα αποτελεί έναν ιδιαίτερα άφθονο και ανανεώσιμο πόρο, η αξιοποίηση του οποίου παρουσιάζει σημαντικό ενδιαφέρον για την παραγωγή βιοκαυσίμων και προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, δημιουργώντας σημαντικές προοπτικές για την μετάβαση προς περισσότερο βιώσιμες διεργασίες και τη μείωση των περιβαλλοντικών επιπτώσεων. Ωστόσο, η εγγενής ανθεκτικότητα και η υψηλή δομική οργάνωση των πολυσακχαριτικών συστατικών της περιορίζουν την αποτελεσματικότητα της ενζυμικής αποικοδόμησης. Στο πλαίσιο αυτό, σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι λυτικές μονοοξυγενάσες πολυσακχαριτών (LPMOs), οξειδοαναγωγικά ένζυμα που συμβάλλουν στην αποικοδόμηση ανθεκτικών πολυσακχαριτικών υποστρωμάτων μέσω οξειδωτικών μηχανισμών. Η συμπληρωματική δράση των LPMOs με τα υδρολυτικά ένζυμα μπορεί να ενισχύσει την αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας, αυξάνοντας την προσβασιμότητα των πολυσακχαριτικών υποστρωμάτων στα υδρολυτικά ένζυμα.
Αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η παραγωγή, η έκφραση και η κρυστάλλωση μίας σημειακά μεταλλαγμένης λυτικής μονοοξυγενάσης πολυσακχαριτών από τον μύκητα Myceliophthora thermophila (MtLPMO9F_Y205A ή Y205A). Το ένζυμο αυτό ανήκει στην οικογένεια AA9, με βάση την κατάταξη στην βάση δεδομένων ενζύμων ενεργών σε υδατάνθρακες (Carbohydrate-Active enZymes, CAZy) και παρουσιάζει ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον λόγω της οξειδωτικής της δράσης σε κυτταρινικά και ημικυτταρινικά υποστρώματα, καθώς και της ικανότητάς της να δρα σε διαλυτούς κελλοολιγοσακχαρίτες. Κατά την διάρκεια της επεξεργασίας του δόθηκε ιδιαίτερη έμφαση στην βελτιστοποίηση των συνθηκών απομάκρυνσης του τομέα πρόσδεσης υδατανθράκων (CBM1) από το καρβοξυλικό άκρο της πρωτεΐνης, με κύριο στόχο την παρασκευή του απομονωμένου καταλυτικού τμήματος Y205AΔCBM για την αξιοποίησή του σε επακόλουθες δοκιμές δομικού χαρακτηρισμού.
Συνοπτικά, εκφράστηκαν η μη μεταλλαγμένη MtLPMO9F και η Y205A μέσω ετερόλογου συστήματος έκφρασης σε ζυμομύκητα Pichia pastoris και ακολούθησαν τα διαδοχικά στάδια ανάκτησης, συμπύκνωσης και καθαρισμού. Έπειτα, ακολούθησε ο αρχικός χαρακτηρισμός των πρωτεϊνικών δειγμάτων, ο οποίος περιλάμβανε μεταξύ άλλων τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης και ηλεκτροφόριση SDS-PAGE. Οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων ανήλθαν σε 26.6 mg/mL και 28.9 mg/mL για την MtLPMO9F και τη Y205A, αντίστοιχα, με τελικό όγκο 1 mL για κάθε δείγμα, που αντιστοιχούσε σε συνολική μάζα 26.6 mg και 28.9 mg, αντίστοιχα. Ακολούθως, διερευνήθηκαν οι συνθήκες απομάκρυνσης του CBM1 με τη χρήση παπαΐνης, δοκιμάζοντας διάφορες αναλογίες ενζύμου:παπαΐνης, χρόνου και θερμοκρασίας επώασης, καθώς και παρουσίας ή απουσίας ανάδευσης, και τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρισης SDS-PAGE. Από τις συνθήκες που εξετάστηκαν, η ευνοϊκότερη συνθήκη περιείχε αναλογία Y205A:παπαΐνη 20:1, με επώαση για 17 h σε θερμοκρασία δωματίου, χωρίς ανάδευση, με την ηλεκτροφόριση SDS-PAGE να εμφανίζει μονή πρωτεϊνική ζώνη στα 26 kDa.
Μετά την πρωτεολυτική αντίδραση, την χρωματογραφία ανιοντοανταλλαγής και την τελική συμπύκνωση προέκυψε δείγμα της απομονωμένης καταλυτικής περιοχής Y205AΔCBM τελικού όγκου 0.75 mL και συγκέντρωσης 15.5 mg/mL, που αντιστοιχούσε σε συνολική μάζα 11.6 mg.
Στην συνέχεια, το Y205AΔCBM αξιοποιήθηκε σε δοκιμές κρυστάλλωσης με τη μέθοδο διάχυσης ατμών με καθίμενη σταγόνα (sitting-drop vapor diffusion), όπου εξετάστηκαν επτά διαφορετικές συνθήκες κρυστάλλωσης, με τις σταγόνες να επωάζονται στους 20 ℃. Μετά από χρονικό διάστημα περίπου 3.5 μηνών δεν παρατηρήθηκε σχηματισμός κρυστάλλων, με τις σταγόνες να παραμένουν διαυγείς.
Συνολικά, η παρούσα εργασία οδήγησε στον προσδιορισμό κατάλληλων συνθηκών για την παραγωγή και την πρωτεολυτική επεξεργασία της Y205A και στην προετοιμασία του καταλυτικού της τμήματος για δοκιμές κρυστάλλωσης. Η περαιτέρω βελτιστοποίηση των συνθηκών κρυστάλλωσης και η μελλοντική δομική μελέτη της Y205AΔCBM, ιδιαίτερα παρουσία κατάλληλου υποστρώματος, μπορούν να συμβάλλουν στην βαθύτερη κατανόηση του ρόλου του αμινοξέος Tyr205 στην αλληλεπίδρασή της MtLPMO9F με το υπόστρωμα.
Description
Keywords
Λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα, Λυτικές μονοοξυγενάσες πολυσακχαριτών, Πρωτεολυτική απομάκρυνση CBM1, Κρυστάλλωση πρωτεϊνών