Κρυσταλλογραφική ανάλυση ενζύμων που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση πλαστικών
Loading...
Date
2025-03-07
Authors
Σαμοΐλη, Πηνελόπη
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η παρούσα διπλωματική εργασία εστίασε στη μελέτη δύο ενζύμων που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση του τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου (Polyethylene terephthalate, PET) και της πολυουρεθάνης (Polyurethane, PU), με τη μέθοδο της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Συγκεκριμένα, τα ένζυμα που μελετήθηκαν είναι μία τροποποιημένη εστεράση του φερουλικού οξέος από τον μύκητα Fusarium oxysporum, με όνομα FoFaeC_G122S, καθώς και μία κουτινάση από τον ίδιο μύκητα, με όνομα FoCut5a. Και τα δύο ένζυμα είναι υδρολυτικά, δηλαδή λειτουργούν παρουσία νερού, καταλύοντας τη διάσπαση εστερικών δεσμών. Η FoFaeC_G122S κατατάσσεται στην οικογένεια των εστερασών του φερουλικού οξέος, ενώ η FoCut5a στην οικογένεια των κουτινασών, οι οποίες κατατάσσονται μεταξύ των λιπασών και των εστερασών. Εκτός από την ικανότητά της να δρα στην κουτίνη, η FoCut5a μπορεί επίσης να δρα σε συνθετικούς πολυεστέρες, γεγονός που την καθιστά ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα για την αποικοδόμηση πλαστικών, όπως το PET και το PU. Όσον αφορά την διαδικασία αποικοδόμησης του PET, τα δύο ένζυμα έχουν διαφορετικό ρόλο. Η FoCut5a έχει δράση PETάσης, ένζυμο που διασπά το PET σε μικρότερα ολιγομερή, ενώ η FoFaeC_G122S είναι MHETάση, υπεύθυνη για τη διάσπαση του μονο(2-υδροξυαιθυλο)τερεφθαλικού οξέος (MHET), ενός ενδιάμεσου προϊόντος στην αποικοδόμηση του PET, σε τερεφθαλικό οξύ και αιθυλενογλυκόλη. Για τον δομικό προσδιορισμό των ενζύμων, εφαρμόστηκε η διαδικασία της κρυστάλλωσης πρωτεϊνών με την τεχνική διάχυσης ατμών και, πιο συγκεκριμένα, με τις μεθόδους της καθήμενης και της κρεμάμενης σταγόνας για τη δημιουργία μονοκρυστάλλων. Έγιναν δοκιμές βελτιστοποίησης των συνθηκών κρυστάλλωσης, αλλά και δοκιμές συγκρυστάλλωσης των ενζύμων με διάφορα υποστρώματα προκειμένου να μελετηθεί ο μηχανισμός δράσης και αλληλεπίδρασης των ενζύμων με τους προσδέτες. Συγκεκριμένα, η FoFaeC_G122S μελετήθηκε για την αποικοδόμηση MHET, ενώ η FoCut5a για την αποικοδόμηση PET και PU. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η συλλογή και η ακτινοβόληση των κρυστάλλων με ακτίνες Χ υπό κρυογονικές συνθήκες στον πειραματικό σταθμό Synchrotron EMBL του Αμβούργου, PETRA III, στο σταθμό P13, ώστε να προσδιοριστεί η τριδιάστατη δομή της FoFaeC_G122S και να βρεθούν δομές κάθε ενζύμου σε σύμπλοκο με τα υποστρώματα που δοκιμάστηκαν. Η περίθλαση ακτίνων Χ παρείχε δεδομένα υψηλής ευκρίνειας, έως και 1.80 Å, επιτρέποντας την επίλυση της κρυσταλλικής δομής της FoFaeC_G122S και την αποκάλυψη για πρώτη φορά της δέσμευσης ενός μορίου βενζοϊκού οξέος στο ενεργό της κέντρο, έπειτα από συγκρυστάλλωση με ΜΗΕΤ. Αντίθετα, στην περίπτωση της FoCut5a, η κρυσταλλική της δομή είχε λυθεί από προηγούμενες μελέτες και, από τις δοκιμές που έγιναν, τόσο με PET όσο και PU ολιγομερή, δεν εντοπίστηκε κάποιος προσδέτης στο ενεργό κέντρο των ενζύμων. Η μελέτη περιελάβανε τη χρήση νέων υποστρωμάτων πολυουρεθάνης τα οποία δεν είχαν προηγουμένως χρησιμοποιηθεί σε κρυσταλλικές δοκιμές, αποτελώντας ένα σημαντικό βήμα για την κατανόηση της εξειδίκευσης και της δράσης της FoCut5a. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η κρυστάλλωση των ανωτέρω ενζύμων, η βελτιστοποίηση των συνθηκών κρυστάλλωσης και η βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης τους μέσω της επίλυσης της μοριακής τους δομής. Η ανάλυση των κρυσταλλικών δομών τους αποσκοπεί στην αποσαφήνιση των μηχανισμών αλληλεπίδρασης με τα υποστρώματά τους, συμβάλλοντας στη μελλοντική βελτιστοποίηση της ενζυμικής τους δράσης.
Description
Keywords
Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, Εστεράση του φερουλικού οξέος, Κουτινάση, Τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο, Πολυουρεθάνη