Μελέτη επίδρασης σημειακών μεταλλάξεων και προσδιορισμός τρισδιάστατης δομής οξειδωτικών ενζύμων
Loading...
Date
2024-10-09
Authors
Κατσιμαντός, Στέφανος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε βιοχημικός και δομικός χαρακτηρισμός δύο οξειδωτικών ενζύμων τα οποία παρουσιάζουν βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον. Συγκεκριμένα, τα ένζυμα που μελετήθηκαν είναι η TtLPMO9F που εντάσσεται στην κατηγορία των λυτικών πολυσακχαριτικών μονοοξυγενάσών (LPMO) και η καταλάση-φαινολοξειδάση (Catalase-Phenoloxidase, CPO) που κατατάσσεται στην ευρύτερη κατηγορία των υπεροξειδασών.
Οι LPMOs αποτελούν οξειδωτικά ένζυμα που περιέχουν χαλκό στο μόριο τους ενώ η δράση τους σχετίζεται με την σχάση γλυκοζιτικών δεσμών σε διάφορους πολυσακχαρίτες και ολιγοσακχαρίτες, καθιστώντας τες χρήσιμα εργαλεία για την αξιοποίηση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας στο τομέα της βιομηχανίας. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της TtLPMO9F και ορισμένων μεταλλαγμάτων αυτής περιλάμβανε την μελέτη ύπαρξης συνεργιτισμού ανάμεσα στα παραπάνω ένζυμα και το εμπορικό μείγμα κυτταρινασών Celluclast (Novozymes) που χρησιμοποιείται ευρέως για την αξιοποίηση των κλασμάτων βιομάζας. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης TtLPMO9F ή μεταλλαγμάτων αυτής στο Celluclast, κατά την αποικοδόμηση λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας προερχόμενης από πεύκο, μετρώντας την συγκέντρωση των απελευθερωμένων αναγωγικών σακχάρων. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων δεν υπέδειξαν σαφή συνεργιτισμό τόσο για τη TtLPMO9F όσο και για τις μεταλλάξεις της.
Η CPO αποτελεί μέρος της ευρύτερης κατηγορίας των υπεροξειδασών, εμφανίζει διπλή δράση ως καταλάση και ως φαινολοξειδάση αναλόγως με τις επικρατούσες συνθήκες και περιέχει την χαρακτηριστική ομάδα αίμης Β στο μόριο της. Για το δομικό χαρακτηρισμό της πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κρυστάλλωσης που περιλάμβαναν μεθόδους συγκρυστάλλωσης και επώασης σε διαλύματα προσδετών καθώς και πειράματα περίθλασης ακτινών Χ. Έπειτα την επιτυχή κρυστάλλωση και την επιλογή κρυστάλλων κατάλληλης μορφολογίας, πραγματοποιήθηκε συλλογή κρυσταλλογραφικών δεδομένων στον πειραματικό σταθμό Ρ13 του synchrotron PETRA III στο Αμβούργο. Τα δεδομένα περίθλασης που προέκυψαν χαρακτηρίζονται από υψηλή ευκρίνεια έως και 1.83 Å γεγονός που οδήγησε στην επιτυχή επίλυση της δομής και την ανάλυση των δομικών χαρακτηριστικών του ενζύμου. Παρατηρήθηκαν δύο τετραμερείς διατάξεις των μορίων της CPO ανά ασύμμετρη μονάδα με συνολικά οκτώ πρωτεϊνικές αλυσίδες καθεμία αποτελούμενη από 509 αμινοξέα. Κάθε αλυσίδα περιλαμβάνει το χαρακτηριστικό μόριο της αίμης Β που αποτελεί και το καταλυτικό κέντρο του ενζύμου. Επιπλέον παρατηρήθηκαν ποικίλα σημεία γλυκοζυλίωσης και συγκεκριμένα στα αμινοξέα Αsn245 και Asn427 κάθε αλυσίδας με διαφορετικό αριθμό μονομερών το καθένα. Από αυτά δεν κατάφεραν να μοντελοποιηθούν όλα λόγω ανεπαρκούς ηλεκτρονιακής πυκνότητας. Τελικά, παρότι έγιναν προσπάθειες συγκρυστάλλωσης δεν παρατηρήθηκε προσδέτης στην λυμένη δομή.
Σκοπός των παραπάνω πειραμάτων αποτέλεσε η εκτεταμένη μελέτη των βιοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών των αντίστοιχων ενζύμων, ώστε να κατανοηθεί βαθύτερα αφενός ο τρόπος αλληλεπίδρασης των LPMO με τα εμπορικά ενζυμικά μείγματα και πιθανώς η αξιοποίηση τους σε διεργασίες μεγαλύτερης κλίμακας και αφετέρου ο τρόπος πρόσδεσης φαινολικών ουσιών στη CPO και συγκεκριμένα ορισμένων φαινολικών ρύπων που συναντώνται στα υδάτινα περιβάλλοντα.
Description
Keywords
Βιοχημικός χαρακτηρισμός, Δομικός χαρακτηρισμός, Λυτικές πολυσακχαριτικές μονοοξυγενάσες, Υπειροξειδάσες