Ανάπτυξη νέων διαγνωστικών μεθόδων για τη βαριά μυασθένεια
Loading...
Date
2012-07-23
Authors
Τράκας, Νικόλαος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η βαριά μυασθένεια (Myasthenia Gravis, MG) είναι μια αυτοάνοση νόσος η οποία χαρακτηρίζεται από διαταραχή στη νευροδιαβίβαση στο επίπεδο της νευρομυϊκής σύναψης. Η διάγνωση της MG βασίζεται στην κλινική συμπτωματολογία η οποία συνεπικουρείται από φαρμακολογικές, ηλεκτροφυσιολογικές και απεικονιστικές δοκιμασίες και επιβεβαιώνεται συνήθως από την ορολογική ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι συστατικών της νευρομυϊκής σύναψης. Οι σύγχρονες διαγνωστικές δοκιμασίες είναι συνήθως ικανές προς ανίχνευση της παρουσίας αντισωμάτων στο 85-90% περίπου των μυασθενών με γενικευμένη MG και στο 50% περίπου των ασθενών με οφθαλμική MG. Το κενό αυτό στη διάγνωση της MG δημιουργεί ένα σημαντικό πρόβλημα στις περισσότερες περιπτώσεις που ελέγχονται επειδή ένα αρνητικό αποτέλεσμα (το οποίο είναι το συχνότερο αποτέλεσμα στη συνήθη εργαστηριακή διάγνωση της MG) αφήνει μία ασάφεια σχετικά με την ύπαρξη MG. Πράγματι, ακόμη και ένας πολύ χαμηλός τίτλος θα μπορούσε να είναι επαρκής για να εξηγήσει την παρουσία της μυασθένειας, δεδομένου ότι δεν έχει διαπιστωθεί σημαντική συσχέτιση μεταξύ του τίτλου των αντισωμάτων και της σοβαρότητας της νόσου στον πληθυσμό των ασθενών. Ως εκ τούτου, υπάρχει αυξανόμενη ανάγκη για την ανάπτυξη ιδιαίτερα ευαίσθητων διαγνωστικών μεθόδων, για την αναμφισβήτητη απόδειξη της νόσου. Η πλέον ευαίσθητη διαγνωστική δοκιμασία είναι η ραδιολογική ανοσοκαθίζηση (Radioimmunoprecipitation assay, RIPA) και ο πλέον σημαντικός περιοριστικός παράγων για την ανίχνευση χαμηλού τίτλου αντισωμάτων, είναι η αδυναμία χρήσης μεγάλου όγκου ορού (μέγιστο είναι ~5-20 μl), η οποία θα καθιστούσε αναγκαία την επακόλουθη χρήση υψηλού όγκου αντί-ορού και η οποία θα οδηγούσε σε υπερβολικά μεγάλα άνοσο-ιζήματα, τα οποία με τη σειρά τους συνδέονται με απαράδεκτα επίπεδα μη ειδικού θορύβου υπόβαθρου. Με την ανάπτυξη στην παρούσα μελέτη της RIPA δύο-σταδίων ξεπεράσθηκαν σε μεγάλο βαθμό τα προβλήματα αυτά. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στην ακινητοποίηση του αντιγόνου-στόχου σε ένα αδιάλυτο υπόστρωμα, ακολουθούμενη από την επώαση με μεγάλους όγκους (π.χ. 0,1-1ml) του προς εξέταση ορού και την επακόλουθη απελευθέρωση των προσδεμένων αντισωμάτων με μικρό όγκο διαλύματος χαμηλού pH, τα οποία στη συνέχεια ανιχνεύονται και τιτλοδοτούνται με απλή RIPA με τη χρήση 125I-σημασμένων αντιγόνων. Δηλαδή χρησιμοποιήθηκε η αρχή του καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας με όχι αυστηρό αλλά με απλό και εύκολο τρόπο, προκειμένου να εμπλουτισθεί ο ορός σε μεγάλο βαθμό στα ειδικά για το αντιγόνο αντισώματα πριν από τον προσδιορισμό και την τιτλοποίηση τους με τις συνήθεις ανοσολογικές δοκιμασίες. Έγινε προσπάθεια ανάπτυξης της προσέγγισης αυτής για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του AChR και έναντι της MuSK. Έγιναν πολλές προσπάθειες για την εφαρμογή της για την ανίχνευση αντί-AChR αυτοαντισωμάτων. Σημειώθηκε μεγάλη πρόοδος, αλλά απαιτούνται επιπρόσθετες βελτιώσεις για την εφαρμογή της στην διάγνωση ρουτίνας. Για την ανίχνευση των αντί-MuSK αυτοαντισωμάτων με την προσέγγιση αυτή επετεύχθη σημαντικότερη βελτίωση. Η παρούσα συστηματική προσέγγιση απεδείχθη τουλάχιστον 20-50 φορές περισσότερο ευαίσθητη από την κλασική RIPA. Όλοι οι οροί οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί προηγουμένως ως θετικοί ή αρνητικοί με την κλασική RIPA βρέθηκαν όπως αναμενόταν επίσης θετικοί ή αρνητικοί αντίστοιχα. Επιπλέον όμως μερικοί εκ των ορών οι οποίοι στο παρελθόν είχαν χαρακτηρισθεί ως αμφίβολοι βρέθηκαν σαφώς θετικοί, ή μερικοί άλλοι οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί ως αρνητικοί αλλά παρουσίαζαν τίτλους ελαφρά υψηλότερους του μηδενός, αλλά όχι στατιστικά σημαντικούς ώστε να αξιολογηθούν ως υψηλότεροι του υπόβαθρου, βρέθηκαν θετικοί, ενώ άλλοι εξακολουθούν να παραμένουν αρνητικοί. Η δοκιμασία που αναπτύξαμε ήταν αρχικά περισσότερο επίπονη από ότι η κλασική RIPA, αλλά με την ανάπτυξη σημαντικών βελτιώσεων, η διαδικασία αυτή έχει απλουστευθεί ώστε να είναι δυνατός ο ταυτόχρονος έλεγχος μεγάλου όγκου (0,1-1 ml) πολλαπλών δειγμάτων ορών και έχει καταστεί δυνατή η χρήση της στην καθημερινή διάγνωση. Η βελτιωμένη αυτή μέθοδος εφαρμόζεται σήμερα για την ανίχνευση αντί-MuSK αντισωμάτων και αποσκοπεί στην ανίχνευση πολύ μικρών ποσοτήτων αυτοαντισωμάτων στον ορό των μυασθενικών οι οποίοι έχουν χαρακτηρισθεί ως οροαρνητικοί ή αμφίβολοι.
Description
Keywords
Βαριά μυασθένεια, Υποδοχέας ακετυλοχολίνης, Ανοσοκαθίζηση