Μαθηματική ανάλυση της ισοθερμικής θερμιδομετρίας για αναγνώριση κινητικών παραμέτρων
Loading...
Date
2024-07-12
Authors
Μηναδάκη, Σοφία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η Ισοθερμική Τιτλοδότηση Θερμιδομετρίας (Isothermal Titration Calorimetry ITC) αποτελεί ένα σημαντικό αναλυτικό εργαλείο για την κατανόηση των δεσμευτικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ δύο μορίων, με το ένα να δρα ως σύνδεσμός και το άλλο ως δέκτης. Ιδιαίτερα στον τομέα της βιολογίας, η ITC έχει αναδειχθεί ως μια καθοριστική τεχνική για την εξερεύνηση διαδικασιών σύνδεσης που αφορούν λιπιδικές μεμβράνες, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα και μακρομόρια. Μέσω της ITC, οι ερευ νητές μπορούν να προσδιορίσουν θεμελιώδεις θερμοδυναμικές παραμέτρους σύνδεσης—όπως ε λεύθερη ενέργεια (Δ𝐺), ενθαλπία (Δ𝐻) και εντροπία (Δ𝐻)—καθώς και στοιχειομετρία σύνδεσης
(𝑛), όλα μέσα από ένα μόνο πείραμα. Το πείραμα διεξάγεται με την έγχυση του συνδέσμου στο κελί
που περιέχει τον υποδοχέα. Στην παραδοσιακή προσέγγιση ή σταδιακή έγχυση ( Incremental Injec tion Approach -ITC), ο σύνδεσμος εισάγεται σταδιακά στο κελί που περιέχει τον δέκτη σε καθορι σμένα διαστήματα, ενώ η θερμότητα συνεχώς παρέχεται ή απορροφάται. Κατά τη διάρκεια της α ντίδρασης, η ισχύς που προσφέρεται ώστε να διατηρηθεί σταθερή θερμοκρασία καταγράφεται και
χρησιμοποιείται για την κατασκευή του θερμογραφήματος . Ο υπολογισμός των θερμοδυναμικών
παραμέτρων—όπως ενθαλπία (ΔH), εντροπία (ΔS), στοιχειομετρική αναλογία (n) και σταθερά ισορ ροπίας (K)—απαιτεί την ολοκλήρωση της περιοχής κάτω από την κορυφή που δημιουργείται μετά
την έγχυση του συνδέτη για να σχηματιστεί το θερμογράφημα. Τα Θερμοδυναμικά δεδομένα υπο λογίζονται στο σημείο καμπής της σιγμοειδούς καμπύλης του θερμογραφήματος.
Επιπλέον, η ITC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό κινητικών παραμέτρων (kinITC)
μέσω μοντέλων με γνωστά κινητικά δεδομένα. Στα πειράματα IIA-ITC, ο υπολογισμός των κινητικών
δεδομένων, όπως ο ρυθμός διάστασης της αντίδρασης (𝑘𝑜𝑓𝑓), επιτυγχάνεται με την προσαρμογή
των προβλέψεων του μοντέλου στο σχήμα κάθε κορυφής στο θερμογράφημα, που προκύπτει από
τη σταδιακή έγχυση του συνδέσμου στο κελί του θερμιδόμετρου. Ωστόσο, η IIA-ITC έχει μικρό α ριθμό πειραματικών σημείων λόγω του πεπερασμένου αριθμού εγχύσεων. Αυτός ο περιορισμός κα θιστά την σταδιακή προσέγγιση λιγότερο αξιόπιστη για θερμοδυναμική σύνδεση συστημάτων συν δέσμου-δέκτη με υψηλή σταθερά ισορροπίας (K).
Η συνεχής έγχυση (CIA-ITC) είναι μια εναλλακτική μέθοδος στην παραδοσιακή προσέγγιση της
σταδιακής έγχυσης. Σε αυτή την τεχνική, γίνεται συνεχής έγχυση του συνδέσμου στο κελί του θερμιδόμετρου. Αυτή η συνεχής έγχυση επιτρέπει την αύξηση της ποσότητας των δεδομένων, με αποτέλεσμα υψηλής πυκνότητας δεδομένα γύρω από το σημείο καμπής της σιγμοειδούς καμπύλης του
θερμογραφήματος. Ο ευκολότερος προσδιορισμός του σημείου καμπής βοηθά στη μείωση του χρόνου του πειράματος και στη διατήρηση των αντιδρώντων, καθώς το πείραμα ολοκληρώνεται μετά
την εκτίμηση των θερμοδυναμικών δεδομένων. Στην περίπτωση της CIA-ITC, η εφαρμογή του kinITC
δεν είναι εφικτή, καθώς η συνεχής έγχυση του συνδέτη δεν οδηγεί στο σχηματισμό κορυφών στο
θερμογράφημα. Δεδομένων των περιορισμών που συναντώνται στον υπολογισμό των κινητικών πα ραμέτρων μέσω της μεθόδου kinITC, έχει αναπτυχθεί μια νέα μεθοδολογία για των υπολογισμό των
επιθυμητών δεδομένων χρησιμοποιώντας το θερμογράφημα που προκύπτει από την CIA-ITC.
Αυτή η νέα μεθοδολογία έχει αναπτυχθεί για τρία διαφορετικά μοντέλα: το μοντέλο του ανεξάρ τητου σημείου σύνδεσης, το μοντέλο του ανταγωνιστικού σημείου σύνδεσης και το μοντέλο των
δύο ανεξάρτητων σημείων σύνδεσης. Η μεθοδολογία για κάθε μοντέλο παραμένει ίδια, με τη μόνη
διαφορά να είναι οι αλγεβρικές και οι διαφορικές εξισώσεις που περιγράφουν το δυναμικό μοντέλο.
Στην περίπτωση των μοντέλων του ανεξάρτητου σημείου πρόσδεσης και των δύο ανεξάρτητων ση μείων πρόσδεσης, παρέχεται μόνο το θερμογράφημα που προκύπτει πειραματικά και μερικές αρχι κές υποθέσεις σχετικά με τις τιμές που πρέπει να υπολογιστούν. Ωστόσο, στην περίπτωση του αντα γωνιστικού μοντέλου, παρέχονται δεδομένα για τη δευτερεύουσα αντίδραση, η οποία είναι αντα γωνιστική με την υπό μελέτη αντίδραση. Αρχικά, πραγματοποιείται μια έρευνα του πεδίου τιμών του ρυθμού αντίδρασης σχηματισμού 𝑘𝑜𝑛, καθώς δεν υπάρχουν διαθέσιμες πληροφορίες για την
τιμή της. Στη συνέχεια, οι θερμοδυναμικές παράμετροι συμπεριλαμβανομένων της ενθαλπίας, της
σταθεράς διάστασης και της στοιχειομετρίας αναλογίας υπολογίζονται χρησιμοποιώντας την αλγε βρική εξίσωση. Αυτές οι παράμετροι υφίστανται διαδοχικές προσαρμογές έως ότου η πειραματική
καμπύλη προσαρμοστεί σε αυτήν του μοντέλου. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από την αλγεβρική
εξίσωση αποτελούν τη βάση για την επακόλουθη ανάλυση χρησιμοποιώντας το δυναμικό μοντέλο.
Τόσο τα Θερμοδυναμικά όσο και τα κινητικά δεδομένα υπολογίζονται εκ νέου χρησιμοποιώντας το
δυναμικό μοντέλο, με τις παραμέτρους να προσαρμόζονται διαδοχικά έως ότου η πειραματική κα μπύλη ταιριάζει με την καμπύλη που προκύπτει από το μοντέλο.
Η παραπάνω μεθοδολογία χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των κινητικών και θερμοδυνα μικών παραμέτρων για όλα τα τρία μοντέλα. Συγκεκριμένα, για το μοντέλο του ανεξάρτητου σημείου
σύνδεσης, χρησιμοποιήθηκε το θερμογράφημα της σύνδεσης του άλφα-λιποϊκού οξέος (αLa) με την
πρωτεΐνη Αβιδίνη, ενώ για τον ανταγωνιστικό δεσμό, χρησιμοποιήθηκε το θερμογράφημα που προ κύπτει από την έγχυση της βιοτίνης d-desthiobiotin (DTB) σε διάλυμα αLa και Αβιδίνης. Για το μο ντέλο των δύο ανεξάρτητων σημείων σύνδεσης, χρησιμοποιήθηκε η σύνδεση των ιόντων Ca+2 σε
διάλυμα αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA) και 1,3-διαμινοπροπάνης-Ν,Ν,Ν',Ν'-τετραοξι κού οξέος (DPTA). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από αυτή τη νέα μέθοδο συγκρίθηκαν με τα
αντίστοιχα βιβλιογραφικά δεδομένα για να επαληθευτεί η ακρίβεια των υπολογισμών.
Description
Keywords
Ισοθερμική θερμιδομετρία, Κινητικές παράμετροι, Μαθηματική ανάλυση