Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας της Ε3 λιγάσης ουβικιτίνης Arkadia
Loading...
Date
Authors
Μπίρκου, Μαρία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η πρωτεΐνη Arkadia/RNF111 είναι η πρώτη Ε3 λιγάση ουβικιτίνης η οποία αναγνωρίστηκε ότι ρυθμίζει θετικά το TGF-β μονοπάτι σηματοδοτώντας για αποικοδόμηση τους αρνητικούς ρυθμιστές του μονοπατιού Smad7, SnoN (SkiL) και SKI. Η Arkadia επιτελεί τη δράση της μέσω της RING-Η2 επικράτειά της την οποία φέρει στο C-τελικό της άκρο. Ο προσδιορισμός της δομής και η μελέτη της αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο UbcH5b του πολυπεπτιδικού τμήματος των 68 καταλοίπων, το οποίο έφερε τη RING επικράτεια, ανέδειξε συντηρημένα κατάλοιπα για τις RING-Η2 Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης τα οποία εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με το Ε2 ένζυμο UbcH5b. Επιπλέον μελέτες αλληλούχισης γονιδιώματος (deep sequencing) του mRNA ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου υπέδειξαν την ύπαρξη μεταλλάξεων εντός της RING επικράτειας της Arkadia όπως η μετάλλαξη της Arg σε Cys στη θέση 957 της ακολουθίας της.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε η μελέτη της επίδρασης μεταλλάξεων σε συντηρημένα κατάλοιπα όπως η Trp στη θέση 972 και η Phe στη θέση 964 της ακολουθίας. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε η μελέτη της επίδρασης της μετάλλαξης Arg957Cys η οποία έχει ανιχνευθεί σε ιστούς ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Η αποτίμηση της επίδρασης των μεταλλάξεων στη δομή καθώς και οι μελέτες αλληλεπίδρασης των μεταλλαγμάτων με το Ε2 ένζυμο UbcH5b πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού το πολυπεπτιδικό τμήμα των 124 καταλοίπων το οποίο αποδείχθηκε ότι φέρει ακολουθίες σημαντικές για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με το UbcH5b και τη λειτουργία της ως λιγάση στο μονοπάτι της ουβικιτινίωσης. Η λειτουργικότητα των μελετώμενων πολυπεπτιδίων της Arkadia ως Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης ελέγχθηκε μέσω πειραμάτων αυτο-ουβικιτινίωσης και δοκιμασίας λουσιφεράσης.
Description
Keywords
NMR φασματοσκοπία, E3 λιγάση, Ουβικιτινίωση