Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων αναλόγων της εκλυτικής ορμόνης της ωχρινοτρόπου ορμόνης (GnRH)
Loading...
Date
2012-01-27
Authors
Παππά, Ελένη Β.
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η Εκλυτική ορμόνη της Ωχρινοτρόπου Ορμόνης των θηλαστικών (GnRH-I ή GnRH) είναι ένα δεκαπεπτίδιο το οποίο εκκρίνεται από τον υποθάλαμο κατά ώσεις. Η GnRH είναι δυνατό να δρα σαν ρυθμιστής διαφόρων συστημάτων τα οποία, για τη λειτουργία τους, απαιτούν την έκκριση της LH και της FSH. Πράγματι, η GnRH και τα ανάλογα της χρησιμοποιούνται εκτεταμένα για τη θεραπεία ενός μεγάλου αριθμού ασθενειών οι οποίες σχετίζονται με τις φυλετικές ορμόνες. Η χρόνια χορήγηση αναλόγων της GnRH προκαλεί απευαισθητοποίηση των υποδοχέων το οποίο οδηγεί στην παύση της έκκρισης γοναδοτροπινών και κατά συνέπεια στην καταστολή της λειτουργίας των ωοθηκών και των όρχεων (chemical castration).
Εκτός από την υπόφυση οι υποδοχείς της GnRH εκφράζονται σε αρκετούς φυσιολογικούς και διάφορους καρκινικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του ωοθηκών, του ενδομητρίου και του προστάτη. Ο ρόλος της GnRH και των υποδοχέων της σε αυτούς τους εξωϋποθαλαμικούς ιστούς δεν έχει ξεκάθαρος. Ωστόσο, έχει δειχθεί ότι σε διάφορα είδη καρκινικών κυττάρων συμπεριλαμβανομένων και των PC3 και LNCaP τα ανάλογα της GnRH αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό ή οδηγούν σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση).
Η lamprey Εκλυτική Ορμόνη της Ωχρινοτρόπου Ορμόνης (lGnRH-III) είναι η τρίτη μορφή της GnRH η οποία έχει απομονωθεί από τα ψάρια του είδους lamprey (το γένος Petromyzon marinus). Αυτό το δεκαπεπτίδιο το οποίο διαφέρει από τη GnRH των ανθρώπων (GnRH-I) στα αμινοξέα των θέσεων 5-8, διεγείρει την απελευθέρωση οιστραδιόλης και της προγεστερόνης στα ενήλικα θηλυκά lamprey αλλά έχει αμελητέα ενδοκρινή δράση στα συστήματα των θηλαστικών. Την τελευταία δεκαετία έχουν δημοσιευτεί στοιχεία τα οποία υποστηρίζουν την απευθείας αντικαρκινική δράση της lGnRH-III. Τα παραπάνω οδηγούν στο χαρακτηρισμό της lGnRH-III ως ένα εξαιρετικό μόριο-οδηγό για την ανάπτυξη αναλόγων της GnRH με αυξημένη και πιθανώς εκλεκτική αντικαρκινική δράση.
Οι πιο πρόσφατες αναφορές για απευθείας δράση των αναλόγων της GnRH στην αναστολή του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων τα οποία παράγουν τη φυσική ορμόνη και εκφράζουν τους υποδοχείς της εγκαινιάζουν ένα νέο πεδίο έρευνας και προσφέρουν νέα ώθηση στο σχεδιασμό και τη σύνθεση νέων αναλόγων της GnRH. Μελέτες οι οποίες διερευνούν τη σχέση δομής-δραστικότητας της GnRH-Ι και ιδιαιτέρως της lGnRH-III και των αναλόγων τους στο εξωϋποθαλαμικό σύστημα είναι περιορισμένες. Η ανάγκη διερεύνησης του πεδίου αυτού θεωρείται μείζονος σημασίας καθώς ο πληθυσμός των καρκινοπαθών αυξάνει συνεχώς και η πάθηση κατατάσσεται μεταξύ των σημαντικότερων πεδίων ερευνητικής μελέτης. Ανάλογα της GnRH χορηγούνται σε ασθενείς με ορμονοεξαρτώμενους όγκους με στόχο την αναστολή των γοναδοτροπινών και την παύση της έκκρισης των φυλετικών ορμονών. Η προσέγγιση του πεδίου με χρήση αναλόγων της GnRH με ενδεχόμενη κυτταροστατική δράση αποτελεί μια σύγχρονη και πολλά υποσχόμενη προοπτική. Από τη άλλη μεριά, ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα το οποίο εμφανίζεται στα φάρμακα πεπτιδικής φύσης είναι η γρήγορη και εκτεταμένη αποικοδόμηση τους από διάφορα ένζυμα. Προκειμένου να βελτιωθεί η βιοδιαθεσιμότητα των αναλόγων της GnRH έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες προσεγγίσεις. Η εισαγωγή N-μεθυλιωμένων-αμινοξέων περιορίζει διαμορφωτικά τον πεπτιδικό σκελετό και χρησιμοποιείται συχνά για την αύξηση της πρωτεολυτικής σταθερότητας των φαρμάκων πεπτιδικής φύσης. Μια πιο ολοκληρωμένη προσέγγιση είναι αυτή η οποία συνδυάζει την σταθερότητα έναντι της ενζυμικής αποικοδόμησης με τη διατήρηση της βιολογικής δράσης.
Στόχος της ∆ιατριβής είναι η συμβολή στο πεδίο των σχέσεων δομής-δραστικότητας της GnRH μέσω του ορθολογικού σχεδιασμού, της ανάπτυξης και του ελέγχου νέων συνθετικών αναλόγων της. Συγκεκριμένα, συνθέσαμε δώδεκα νέα ανάλογα τα οποία περιλαμβάνουν διαμορφωτικά περιορισμένα αμινοξέα στις θέσεις 4 και 6 και μελετήσαμε τις δομικές αλλαγές οι οποίες προκύπτουν από τις αλλαγές αυτές με φασματοσκοπία NMR, τη σταθερότητα έναντι της ενζυμικής αποικοδόμησης από την α-χυμοθρυψίνη και τη σουμπτιλισίνη και την δράση τους επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων PC3 και LNCaP. Η NMeSer εισήχθη στη θέση 4 του μορίου αντικαθιστώντας τη Ser και η Gly6 αντικαταστάθηκε από διάφορα D- αμινοξέα (DLys, Nε- τροποποιημένη DLys, Glu, DGlu). Το Ν-τελικό γλυκιναμίδιο έχει επαλειφθεί και στη θέση του έχει γίνει εισαγωγή της αιθυλ-ομάδας (Fujino modification), όπως στο μόριο του Λεουπρολιδίου. Συνθέσαμε επίσης είκοσι δύο νέα ανάλογα της lGnRH-III με τροποποιήσεις σε διάφορες θέσεις του μορίου και μελετήσαμε τη δράση τους επί του πολλαπλασιασμού των PC3 και LNCaP κυττάρων. Η Asp6 της lGnRH-III αντικαταστάθηκε από Asn, Asn(OMe), Glu ή Gln, η Trp3,7 από DTrp ή L/D-Tic, το pGlu1 αντικαταστάθηκε από Glu ή Ac-Glu και η His5 με την Lys8 άλλαξαν μεταξύ τους θέσεις. Επιπλέον, συνθέσαμε και τέσσερα κυκλικά ανάλογα της lGnRH-III καθώς τα κυκλικά πεπτίδια συχνά χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη μεταβολική σταθερότητα και δραστικότητα σε σχέση με τα ευθύγραμμα. Τέλος, μελετήσαμε τη δομή της lGnRH-III με τη χρήση ΝΜR φασματοσκοπίας και τα χαρακτηριστικά της παρουσιάζονται σε σύγκριση με αυτά της GnRH-I. Για τη σύνθεση των αναλόγων της GnRH-I σαν στερεό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε η [3-(αιθυλ-Ν-Fmoc-αμινομέθυλ)ινδολ-1- υλ] ακετυλ ΑΜ ρητίνη για την παραλαβή αμιδίων ενώ, για τη σύνθεση της GnRH-I, της lGnRH-III και των αναλόγων της lGnRH-III χρησιμοποιήθηκε η ρητίνη του Sieber χρησιμοποιώντας την Fmoc/tBu μεθοδολογία. Η ενζυμική σταθερότητα των αναλόγων της GnRH-I προσδιορίστηκε έπειτα από επώαση των πεπτιδίων με την α-Chymotrypsin και τη Subtilisin ενώ, η δράση έναντι του κυτταρικού πολλαπλασιασμού της GnRH-I, της lGnRH-III και των αναλόγων τους μελετήθηκε με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη (PC3 και LNCaP).
Το πρωτόκολλο σύνθεσης το οποίο ακολουθήθηκε οδήγησε στην παραλαβή πεπτιδίων σε μεγάλες αποδόσεις και υψηλή καθαρότητα. Η μελέτη της επίδρασης των νέων αναλόγων της GnRH στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη εγκαινιάζει το πεδίο σε επίπεδο σχέσεων δομής-δραστικότητας και συνεισφέρει στην αδιάκοπη έρευνα των δομικών απαιτήσεων των αναλόγων της GnRH προσφέροντας νέες προοπτικές στον σχεδιασμό δραστικών αναλόγων της GnRH. Tέλος, προέκυψαν πεπτιδικά ανάλογα της ορμόνης τα οποία σε σχέση με το Λεουπρολίδιο, το οποίο αποτελεί δραστικό συστατικό φαρμάκων για την αντιμετώπιση των ανωτέρω ασθενειών και με τη lGnRH-III, εμφανίζονται στις βιολογικές δοκιμές στις οποίες εξετάστηκαν δραστικότερα και με αυξημένη πρωτεολυτική σταθερότητα και συνεπώς αποτελούν καλές, υποψήφιες για περαιτέρω βιολογική/κλινική μελέτη, ενώσεις. Σε επίπεδο σχέσεων δομής-δραστικότητας οι τελευταίες είναι δυνατόν να αποτελέσουν τη βάση για τον μελλοντικό σχεδιασμό νέων αναλόγων της GnRH με υψηλή δραστικότητα και ενδεχόμενη φαρμακευτική εφαρμογή.
Description
Keywords
Δεκαπεπτίδια, Ανάλογα, Εκλυτική ορμόνη της ωχρινοτρόπου ορμόνης