Έκφραση και δομική μελέτη τμημάτων του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης
Loading...
Date
2009-08-19T07:58:51Z
Authors
Ζουριδάκης, Μάριος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια
των πενταμερών ιοντικών καναλιών (LGICs), που περιλαμβάνει τους υποδοχείς
σεροτονίνης (5-HT3), γλυκίνης (GlyR) και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA, GABAB).
Κάθε υπομονάδα του nAChR αποτελείται από μία αμινο-τελική εξωκυτταρική περιοχή
(ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας, από
τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Οι nAChRs
διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρικούς.
Οι μυϊκοί nAChRs βρίσκονται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων Torpedo sp. και στις
νευρομυϊκές συνάψεις σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν τις νευρικές ώσεις στους μείς.
Σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ στα
ενήλικα άτομα θηλαστικών, με δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των
α1-ΕΚΠ και της γ(ε) και δ-ΕΚΠ. Στην α1-ΕΚΠ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος
περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται αντι-nAChR αντισώματα στην περίπτωση
της βαριάς μυασθένειας. Οι νευρικοί nAChRs βρίσκονται στο κεντρικό και περιφερικό
νευρικό σύστημα, όπου διαβιβάζουν τις νευρικές ώσεις. Σχηματίζουν είτε ετεροπενταμερή,
μεταξύ 2-3 α-υπομονάδων (υπότυποι α2-6) και 2-3 β-υπομονάδων (υπότυποι β2-4), ή
ομοπενταμερή. Η α7 είναι η μόνη γνωστή υπομονάδα του νευρικού nAChR που σχηματίζει
ομοπενταμερή μόρια στον άνθρωπο, με πέντε θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών
υποκαταστατών.
Μέχρι στιγμής, έχουν πραγματοποιηθεί τέσσερα σημαντικά επιτεύγματα, όσον αφορά
την κατανόηση της δομής των nAChRs: Α. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία
ακτίνων-Χ, της ομόλογης προς τα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nAChR (25%
αμινοξική ταύτιση με την α7), ομοπενταμερούς πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh
γαστεροπόδων (AChBP), καθώς και των δομών της με διάφορους χολινεργικούς
προσδέτες. Προσεγγίστηκε έτσι για πρώτη φορά η διαμόρφωση των nAChR-θέσεων
πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών. Β. Η λύση της δομής, με ηλεκτρονική
μικροσκοπία, του Torpedo nAChR, η οποία αποκάλυψε την δευτεροταγή και τριτοταγή
δομή του nAChR. Εντούτοις, λόγω της περιορισμένης ευκρίνειας (4 Å), δεν αποκάλυψε τη
συγκρότηση των θέσεων πρόσδεσης της ACh σε ατομικό επίπεδο. Γ. Η λύση της δομής σε
υψηλή ευκρίνεια (1,94 Å) του συμπλόκου της α1-ΕΚΠ επίμυος με τον nAChR-
ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx). Η λυση αυτής της δομής αποκάλυψε σε ατομικό
επίπεδο την MIR περιοχή, τις θηλιές Α, B και C της κυρίως πλευράς των θέσεων
πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών και τη χαρακτηριστική Cys θηλιά. Δεδομένου όμως,
ότι η δομή της α1-ΕΚΠ αναπαριστά ένα μονομερές, η δομή μίας πλήρως διαμορφωμένης
θέσης πρόσδεσης εξακολουθεί να απουσιάζει. Δ. Η λύση της δομής, με κρυσταλλογραφία
ακτίνων-Χ, μίας προκαρυωτικής LGIC πρωτεΐνης (ELIC), η οποία θεωρείται μάλιστα πως
αποτελεί τον πρόγονο όλων των ευκαρυωτικών LGICs, συμπεριλαμαβανομένου του
nAChR, με την οποία αποκαλύφθηκε ο βασικός σκελετός της δομής των LGICs. Είναι
φανερό, ότι παρόλα αυτά τα επιτεύγματα, απουσιάζει ακόμη η λύση της δομής ενός
πενταμερούς nAChR. Η νευρική α7 υπομονάδα του nAChR είναι μία καλή υποψήφια για
την επίτευξη αυτού του στόχου, αφού σχηματίζει πενταμερή in vivo. Επιπλέον, αυτή
εμπλέκεται σε ένα μεγάλο αριθμό νευρικών παθήσεων (Alzheimer, Parkinson, επιληψία,
σχιζοφρένεια, κλπ), και η λύση της δομής της θα οδηγήσει και στο σχεδιασμό
θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι αυτών των ασθενειών. Μάλιστα, εφ’όσον στην α7-
ΕΚΠ εδράζουν οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, είναι πιο ρεαλιστική η
προσπάθεια κρυστάλλωσης αυτής της περιοχής αντί ολόκληρου του α7 nAChR, αφού οι
εκτενείς υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές του τελευταίου περιορίζουν τη διαλυτότητά
του.
Στο παρελθόν είχαμε εκφράσει στο Εργαστήριό μας την ανθρώπινη α7-EKΠ αγρίου
τύπου και ένα διπλό μετάλλαγμα αυτής, σε κύτταρα P. pastoris, με στόχο μελέτη της δομής
τους. Τα μόρια αγρίου τύπου, βρέθηκαν όμως να είναι αρκετά υδρόφοβα, αφού
εκφράσθηκαν ως συσσωματώματα πολύ υψηλού μοριακού βάρους (ΜΒ) και ως ολιγομερή
μεγαλύτερα από πενταμερή. Τα μόρια του διπλού μεταλλάγματος, στα οποία ολόκληρη η
Cys θηλιά του α7 nAChR αντικαταστάθηκε από την πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της AChBP
σε συνδυασμό με την μετάλλαξη Cys116Ser, εμφάνισαν μεν αυξημένη διαλυτότητα και
ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, διατήρησαν όμως δε ένα σημαντικό βαθμό δημιουργίας
συσσωματωμάτων υψηλού ΜΒ, οδηγώντας σε αποτυχείς προσπάθειες κρυστάλλωσής τους.
Στην παρούσα μελέτη, στηριχθήκαμε στο τρισδιάστατο μοντέλο της ανθρώπινης α7-
ΕΚΠ, το οποίο κατασκευάσαμε χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία τις, μόνες γνωστές έως τότε,
δομές της AChBP και της α-EKΠ του Torpedo nAChR, προκειμένου να σχεδιάσουμε νέες
μεταλλάξεις για την ενίσχυση της διαλυτότητας και της πενταμερούς συγκρότησης των α7-
ΕΚΠ μορίων. Έτσι, μεταλλάξαμε τα εκτεινόμενα, στο εξωτερικό περιβάλλον του μοντέλου,
υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα προς λιγότερο υδρόφοβα, με στόχο την αύξηση της
διαλυτότητας των εκφραζόμενων α7-ΕΚΠ μορίων, καθώς και μερικά κατάλοιπα της
διεπιφάνειας μεταξύ γειτονικών α7-ΕΚΠ πρωτομερών προς μεγαλύτερα ή φορτισμένα, με
στόχο την εισαγωγή επιπλέον υδρογονικών ή ηλεκτροστατικών δεσμών με αντικρυστά
κατάλοιπα της γειτονικής α7-ΕΚΠ υπομονάδας. Η μελέτη των χρωματογραφημάτων
μοριακής διήθησης και δυναμικής σκέδασης του φωτός όλων των προκύπτοντων α7-ΕΚΠ
μεταλλαγμάτων υπέδειξε ότι αυτά που έφεραν μεταλλάξεις σε κατάλοιπα της διεπιφάνειας
εκφράσθηκαν όπως τα μόρια αγρίου-τύπου, ενώ αυτά που έφεραν την αντικατάσταση των
εκτειθέμενων υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων από λιγότερο υδρόφοβα, εμφάνισαν
σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου. Μάλιστα, ένα
τουλάχιστον τέτοιο μετάλλαγμα (mut-10), εμφάνισε σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα και
ως προς το προϋπάρχον διπλό μετάλλαγμα, αφού εκφράσθηκε αποκλειστικά υπό τη μορφή
ολιγομερών με κοντινό στο θεωρητικά αναμενόμενο ΜΒ για πενταμερή μόρια. Επιπλέον,
εμφάνισε μία σημαντικά αυξημένη συγγένεια πρόσδεσης για τον σημασμένο ανταγωνιστή
125I-α-bgtx (Kd = 24 nM), σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου (Kd = 70 nM) και διπλού
μεταλλάγματος (Kd = 52 nM), η οποία πρόσδεση βρέθηκε να αναστέλλεται από μη
σημασμένα μόρια α-bgtx, d-τουμποκουραρίνης ή νικοτίνης (Ki = 21,5 nM, Ki = 127 μM, Ki
= 17,5 mM, αντίστοιχα). Οι τιμές αυτές των σταθερών για το mut-10 είναι χαμηλότερες
από αυτές των μορίων αγρίου τύπου και άλλων μεταλλαγμάτων, ενώ είναι αρκετά κοντινές
προς αυτές του φυσικού μορίου α7 nAChR, υποδηλώνοντας ταυτόχρονα την αύξηση στην
ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, αλλά και την κοντινή διαμόρφωση
του mut-10 στο χώρο με αυτό των φυσικών μορίων. Επιπρόσθετα, μελέτες κυκλικού
διχρωϊσμού, αποκάλυψαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα mut-10
μόρια, καθώς και τοπικές αλλαγές στη διαμόρφωσή τους κατά την πρόσδεση διάφορων
χολινεργικών προσδετών. Επίσης, αποκάλυψαν τη σύσταση της δευτεροταγούς δομής των
ανθρώπινων α7-ΕΚΠ μορίων, η οποία βρέθηκε να είναι ~45% β-πτυχωτή επιφάνεια και 5%
α-έλικα, σε συμφωνία με αυτή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR, της
AChBP και της α1-EKΠ του nAChR επίμυος. Τέλος, με ηλεκτρονική μικροσκοπία
αποκαλύφθηκε ένας υψηλός βαθμός ομοιογένειας των εκφραζόμενων mut-10 μορίων, και η
συγκρότησή τους πιθανότατα σε πενταμερή με εμφανή το χαρακτηριστικό κεντρικό πόρο, ο
οποίος αποτελεί την απαρχή του ιοντικού καναλιού σε ολόκληρο τον α7 nAChR.
Συμπερασματικά, το μετάλλαγμα mut-10 της παρούσης μελέτης είναι κατάλληλο για
δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, απαραίτητες για την έναρξη ενός ορθολογικού
σχεδιασμού φαρμάκων έναντι των ασθενειών που συνδέονται με τον α7 nAChR. Επιπλέον,
δεδομένου ότι τα απογλυκοζυλιωμένα mut-10 μόρια διατήρησαν την υδροφιλικότητα, την
ικανότητα πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών και τη δευτεροταγή τους δομή, αυτά
είναι επίσης κατάλληλα για κρυσταλλώσεις, αφού μάλιστα σε αυτή την περίπτωση
αυξάνεται πιθανότατα και ο βαθμός ομοιογένειάς τους.
Ένας παράλληλος σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η ανίχνευση με μελέτες
κυκλικού διχρωϊσμού, της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των α1-, β1-, γ- και ε-
ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR, τα οποία είχαν επίσης εκφρασθεί σε κύτταρα
P. pastoris. Οι μελέτες αυτές αποκάλυψαν ότι το κυρίαρχο δευτεροταγές δομικό
χαρακτηριστικό όλων αυτών των μορίων ήταν η β-πτυχωτή επιφάνεια (~40%), ενώ
παρατηρήθηκε και μία μικρή συμμετοχή α-έλικας (~5%), σε συμφωνία με την δευτεροταγή
δομή των ομόλογων ΕΚΠ τμημάτων του Torpedo nAChR και της AChBP και με τη
μεταγενέστερη των αποτελεσμάτων αυτών, λύση της δομής της α1-ΕΚΠ του nAChR
επίμυος. Επίσης, επιβεβαίωσαν την ύπαρξη καλά ορισμένης τριτοταγούς δομής στα μόρια
αυτά, κάτι που είχε στο παρελθόν υπαινιγχθεί από βιοχημικές και ανοσοχημικές μελέτες.
Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν την κοντινή προς τα φυσικά μόρια διαμόρφωση των
ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nAChR που εκφράζονται στο Εργαστήριό μας, και
ενισχύουν τη χρήση τους για περαιτέρω δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης, αλλά και ως
ειδικούς ανοσοπροσροφητές των αντι-nAChR αντισωμάτων ορών μυασθενικών σε μία, υπό
ανάπτυξη από το Εργαστήριό μας, αντιγονο-ειδική θεραπευτική προσέγγιση της βαριάς
μυασθένειας.
Description
Keywords
Υποδοχέας ακετυλοχολίνης, Δομή, Νευρασθένειες, Μυασθένεια