Ανάπτυξη μεθόδων για την in vivo ποσοτικοποίηση της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου στους οργανισμούς

Loading...
Thumbnail Image

Date

Authors

Ζησιμόπουλος, Δημήτριος

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Publisher

Abstract

Η μελέτη παρουσιάζει μια νέα μέθοδο που εντοπίζει την ελεύθερη ρίζα O2•−, μέσω ποσοτικοποίησης του 2-υδροξυεθιδίου (2-ΟΗ-Ε+), με ευαισθησία ~30 fmoles με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης (High-Performance Thin Layer Chromatography/ΗPTLC). Η μέθοδος απομονώνει το 2-ΟΗ-Ε+ μετά από την εκχύλισή του με το ανιονικό απορρυπαντικό SDS (σε συγκέντρωση 18 φορές μεγαλύτερη από τη κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση) μαζί με συγκεκριμένα οργανικά/ανόργανα αντιδραστήρια, και το διαχωρισμό του από τα μόρια εθίδιο (Ε+) και διεθίδιο (di-Ε+), μέσω της HPTLC. Η ποσοτικοποίηση του 2-ΟΗ-Ε+ βασίζεται στα μέγιστα ex/em στα 290/540 nm, και για τα E+ και di-E+ στα 295/545 nm. Οι πιο σημαντικές καινοτομίες της παρούσας μεθόδου είναι η ανάπτυξη πρωτοκόλλων για (α) την αποτελεσματική εκχύλιση (με το SDS) και (β) την ευαίσθητη ποσοτικοποίηση (με την HPTLC) του 2-OH-E+ (καθώς και των E+ και di-E+) από τα περισσότερα βιολογικά συστήματα (ζώα, φυτά, κύτταρα, υποκυτταρικά οργανίδια, υγρά). Η μέθοδος εκχυλίζει το 2-ΟΗ-Ε+ (εξουδετερώνοντας τους ισχυρούς δεσμούς μεταξύ των τεταρτοταγών τους N+ και των αρνητικά φορτισμένων ομάδων στα φωσφολιπίδια, το DNA κ.λπ.) μαζί με το υδροεθίδιο (HE), προστατεύει και τα δύο μόρια από βιολογικές οξειδάσες, ενώ εκχυλίζει/ποσοτικοποιεί τις ολικές πρωτεΐνες (υδρόφιλες/υδρόφοβες) για να εκφράζονται τα επίπεδα της ελεύθερης ρίζας O2•− ανά βάρος πρωτεΐνης. Επίσης, η μέθοδος χρησιμοποιεί επίσης το SDS (σε συγκέντρωση 80 φορές μικρότερη από τη CMC) για να εκχυλίσει/απομακρύνει/πλύνει το 2-ΟΗ-Ε+ από την εξωτερική μεμβράνη κυττάρων/οργανιδίων και έτσι να ποσοτικοποιείται με ακρίβεια το εσωτερικό περιεχόμενο του 2-ΟΗ-Ε+. Η νέα μέθοδος εφαρμόστηκε σε ενδεικτικά βιολογικά συστήματα, στα οποία η πρόκληση του οξειδωτικού stress (καταπόνηση) έγινε: (1) με τεχνητό τρόπο μέσω της χορήγησης σε ποντικούς της ουσίας paraquat, η οποία είναι γνωστή για τις οξειδωτικές ιδιότητες και την επαγωγή ελευθέρων ριζών, και (2) με φυσιολογικό τρόπο σε φύλλα κουνουπιδιού μέσω της έκθεσής τους σε φως.

Description

Keywords

Ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου, Οξειδωτικό stress

Citation