Τμήμα Βιολογίας (ΔΔ)

Permanent URI for this collection

Browse

Recent Submissions

Now showing 1 - 20 of 201
  • ItemOpen Access
    Μελέτη της δραστικότητας του πρωτεασώματος στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα και διερεύνηση του μηχανισμού αντοχής στους αναστολείς του
    (2024-02-29) Ζαφειροπούλου, Καλλιόπη; Zafeiropoulou, Kalliopi
    Τα ΜΔΣ είναι μια ομάδα κλωνικών αιμοποιητικών διαταραχών με αυξημένο κίνδυνο μετασχηματισμού σε οξεία μυελογενή λευχαιμία. Οι αναστολείς πρωτεασώματος όπως η Βορτεζομίμπη αποτελούν στοχευμένη θεραπεία για διάφορους τύπους αιματολογικών κακοηθειών, στοχεύοντας το καθοριστικής σημασίας για τα καρκινικά κύτταρα σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεασώματος. Η αναποτελεσματικότητα των αναστολέων πρωτεασώματος στα ΜΔΣ διερευνάται επί του παρόντος, αν και δεν είναι σαφές εάν αναπτύσσουν γρήγορα αντίσταση στο φάρμακο ή εάν η πρωτεολυτική δραστηριότητα του πρωτεασώματος είναι ιδιοσυστατικά χαμηλότερη σε αυτά τα κύτταρα, περιορίζοντας έτσι τα θεραπευτικά αποτελέσματα του φαρμάκου. Στην παρούσα διατριβή, ασθενείς με ΜΔΣ στρατολογήθηκαν και ομαδοποιήθηκαν σύμφωνα με τη βαθμολογία IPSS τους σε ομάδες χαμηλότερου ή υψηλότερου κινδύνου και προσδιορίστηκε η πρωτεασωματική δραστηριότητα και τα επίπεδα δραστικών μορφών οξυγόνου στα μονοπύρηνα κύτταρα αίματος και μυελού των οστών. Παράλληλα, με σκοπό να μελετηθεί η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στους πρωτεασωματικούς αναστολείς, σε μοντέλο συμπαγούς όγκου, και να συγκριθούν οι δύο καταστάσεις, δημιουργήθηκε ανθεκτική κυτταρική σειρά βασισμένη στην προστατική σειρά DU-145. Μελετήθηκαν οι σχετικές με την ανθεκτικότητα κυτταρικές λειτουργίες με έμφαση στη σηματοδότηση, τα επίπεδα δραστικών μορφών οξυγόνου και τον κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματα της μελέτης κατέδειξαν μια στενή σύνδεση μεταξύ της πρωτεασωματικής δραστικότητας, της διαχείρισης της οξειδωτικής καταπόνησης και της επαγωγής της αυτοφαγίας ως εναλλακτικό πρωτεολυτικό μηχανισμό.
  • ItemOpen Access
    Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Prox1 στον καρκίνο του μαστού
    (2023-12) Μιχαήλ, Άρτεμις; Michail, Artemis
    Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την δεύτερη βασικότερη αιτία θανάτου στις γυναίκες παγκόσμια. Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί στις ιατροβιολογικές επιστήμες και τις παρεχόμενες θεραπείες, ο καρκίνος του μαστού χαρακτηρίζεται από ταχεία ανάπτυξη και χαμηλά ποσοστά επιβίωσης. Οι παρατηρήσεις αυτές υπογραμμίζουν την ανάγκη για περαιτέρω εμβάθυνση και μελέτη σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης της κακοήθειας. Προς την κατεύθυνση αυτή, μελετήσαμε τον μεταγραφικό παράγοντα Prox1 ο οποίος διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην καταστολή του καρκίνου του μαστού. Συγκεκριμένα, η βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από όγκους ασθενών που βρίσκονται σε βάσεις δεδομένων, όπως το Oncomine (www.oncomine.org) και το TCGA (The Cancer Genome Atlas, www.cancergenome.nih.gov), έδειξε ότι ο Prox1 μειώνεται δραματικά στους όγκους του μαστού λόγω επιγενετικής αποσιώπησης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι το Prox1 καταστέλλει έντονα τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων μαστού, χωρίς να προάγει την απόπτωση. Ακόμη, ενδιαφέρον εύρημα της παρούσας μελέτης ήταν η παρατήρηση ότι η υπερ-έκφραση του Prox1 οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα γλυκόζης και γαλακτικού οξέος στο υπερκείμενο των μαστικών καρκινικών κυττάρων. Η μοριακή εμβάθυνση αυτής της παρατήρησης κατέδειξε ότι το Prox1 καταστέλλει την έκφραση του γονιδίου c-Myc, καθώς και των γονιδίων που ρυθμίζονται από το c-Myc (συμπεριλαμβανομένου του Glut1, του HK2 και του PDK1, που αποτελεί βασικό ρυθμιστή της γλυκόλυσης), καθώς και την επαγωγή του MPC1, του μιτοχονδριακού μεταφορέα πυροσταφυλικού. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ότι το Prox1 μπορεί να αναστείλει την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων μαστού να παράγουν ATP κυρίως μέσω της γλυκόλυσης και της παραγωγής γαλακτικού οξέος (φαινόμενο Warburg). Σε συμφωνία με τις παραπάνω παρατηρήσεις, το Prox1 καταστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των όγκων του μαστού in vivo σε ετεροτοπικά και ορθοτοπικά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικών. Συνοπτικά, η μελέτη μας καθιερώνει το Prox1 ως παράγοντα αναστολής του όγκου μέσω της αρνητικής ρύθμισης του c Myc και της γλυκόλυσης και ως δυνητικά θεραπευτικό στόχο στον καρκίνο του μαστού.
  • ItemOpen Access
    Phenotypic and functional characterization of Circulating Tumor Cells (CTCs) from breast cancer patients with emphasis on triple negative (ER-/PR-/ HER2-) breast cancer (TNBC)
    (2024-01-18) Βάρδας, Βασίλειος; Vardas, Vasileios
    Triple-negative breast cancer (TNBC) stands out as the most aggressive breast cancer subtype, characterized by a lack of expression of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). Despite its aggressive nature, TNBC faces a significant dearth of targeted therapies, highlighting the pressing need for the identification of novel biomarkers. Notably, metastasis is responsible for approximately 90% of breast cancer-related deaths, with a pivotal role attributed to Circulating Tumor Cells (CTCs). Particularly, metastatic dissemination is associated with the presence of CTCs and Disseminated Tumor Cells (DTCs) in peripheral blood and bone marrow, respectively. However, metastasis is still not well understood and is largely incurable. Hence, there is an urgent need to explore the mechanisms that govern metastatic spread of cancer cells. Microtentacles (McTNs), are tubulin-based protrusions of the plasma membrane playing a pivotal role in the metastatic cascade. They are also associated with the Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) pathway. In this context, the detection and characterization of CTCs exhibiting an EMT phenotype is very important. These cells are of particular interest due to their potential association with high-risk prognosis and increased susceptibility to relapse and mortality. Traditionally, methods reliant on epithelial markers may inadvertently underestimate CTC numbers, necessitating a shift toward more comprehensive approaches. Moreover, BRCA1 mutations have been implicated in the predisposition to TNBC. The intricate interplay between BRCA1, PARP, and the DNA damage repair pathways further amplifies the significance of these factors in TNBC pathogenesis. Against this backdrop, our research aimed to contribute to the understanding of TNBC by examining the phenotype of CTCs in a cohort of 64 TNBC patients. An additional group of 30 hormonal-positive (luminal) patients were included in our analysis to provide a comparative context. Our investigation was focused on elucidating the expression profiles of key biomarkers, such as immune checkpoints(PD-L1, CTLA-4) and EMT-related molecules (GLU, VIM), in CTCs. These markers proved to be valuable indicators of disease severity and clinical outcomes. Furthermore, our study employed advanced technologies, including the FDA-approved CellSearch system to explore vimentin expression and the EMT phenotype in CTCs. This analysis, both in early and metastatic patients, revealed a novel (CK-VIM+CD45-) phenotype which enabled the detection of elusive cancer cells, offering insights into breast cancer prognosis and therapeutic strategies. Additionally, our research extended beyond mere characterization to functional analysis. Leveraging the innovative TetherChips technology from the University of Maryland, our study explored the metastatic potential through McTN formation, and biomarker expression in viable CTCs isolated from TNBC patients post-treated with Vinorelbine (Vin), an FDA-approved drug. The rapid effects observed within just one hour on McTN formation, expression of key biomarkers, and apoptosis, suggest Vinorelbine as a potential strategy to inhibit metastatic spread in TNBC patients. Our findings also highlighted the importance of the functional analysis of CTCs, using TetherChips technology as a valuable tool for real-time investigation of drug efficacy on isolated, cultured CTCs. Furthermore, our investigation examined the effects of a new Combrestatin A4 (CA-4) analog on TNBC cell lines (MDA-MB-231 and MDA-MB-436), assessing viability, cytoskeletal organization (McTNs), migration capacity, and expression of important biomarkers (PD-L1, ΑΑ-TUBULIN, and VIM). The investigation of mutations in BRCA1 exon 20 and their correlation with PARP-1 expression in CTCs of TNBC patients added another layer of depth to our research. High nuclear expression of PARP-1 and the presence of BRCA1 mutations were identified as distinctive features of TNBC CTCs, offering biomarkers linked to patients' clinical outcomes and potentially the PARP-1 targeted therapies. In conclusion, our comprehensive research not only advances the understanding of TNBC but also opens promising avenues for assessing important biomarkers and new insights into personalized treatment approaches. The comprehensive knowledge gained from this study contributes to the evolving landscape of TNBC research, paving the way to target metastatic dissemination.
  • ItemOpen Access
    Μελέτη του ρόλου στοιχείων του μικροπεριβάλλοντος στη ρύθμιση των νευροβλαστικών κυττάρων του εγκεφάλου σε νευροεκφυλιστικά φαινόμενα, καθώς και ως νευροπροστατευτικών παραγόντων
    (2023-11-14) Ανέστη, Μαρία; Anesti, Maria
    Στον ενήλικο εγκέφαλο των θηλαστικών, τα νευρικά βλαστικά κύτταρα (Neural Stem Cells, NSCs) εντοπίζονται σε εξειδικευμένες περιοχές, που ονομάζονται βλαστικές φωλεές, μια εκ των οποίων είναι η Υποεπενδυματική Ζώνη (Subependymal Zone, SEZ) των πλάγιων τοιχωμάτων των πλάγιων κοιλιών. Η νευρογενετική φωλεά της Υποεπενδυματικής Ζώνης αποτελεί ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον, καθώς παρουσιάζει μια ειδική τρισδιάστατη κυτταρική αρχιτεκτονική με αυξημένες αλληλοεπιδράσεις μεταξύ των προγονικών και άλλων κυττάρων, καθώς και ένα εξειδικευμένο σύστημα μορίων εξωκυττάριας ουσίας και αγγείων. Μεταξύ αυτών, η λαμινίνη αποτελεί ένα κύριο μόριο εξωκυττάριας ουσίας στην Υποεπενδυματική ζώνη του ενήλικου εγκεφάλου, ενώ τα αιμοπετάλια πρόσφατα έχουν αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός πληθυσμός της νευροαγγειακής μονάδας, ιδιαίτερα σε νευροπαθολογικές καταστάσεις του εγκεφάλου. Οι κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και τα σήματα που δέχονται τα νευρικά βλαστικά κύτταρα εντός της φωλεάς διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ισορροπία μεταξύ αδράνειας και ενεργοποίησής τους, η οποία διαταράσσεται σε περιπτώσεις τραυματισμού. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αποκαλύπτουν ότι προγονικά κύτταρα νευρικής και ολιγοδενδρογλοιακής μοίρας παρουσιάζουν αποκλίνουσες ιδιότητες και διαφορετική απόκριση στους παράγοντες του μικροπεριβάλλοντος σε πολυμορφικές καλλιέργειες NSCs in vitro, αντανακλώντας τη διαφορετική προσαρμογή τους εντός του εγκεφάλου. Πιο συγκεκριμένα, προτείνεται ότι η νευρογένεση επηρεάζεται σημαντικά από την κυτταρική αρχιτεκτονική, εμφανίζοντας μεγαλύτερους χωρικούς περιορισμούς, ενώ παρουσιάζει και μια μεγαλύτερη εξάρτηση από τη λαμινίνη, σε σχέση με την ολιγοδενδρογένεση. Επιπρόσθετα, η αναστολή της β1 υπομονάδας των κύριων υποδοχέων εξωκυττάριας ουσίας, των ιντεγκρινών, ενίσχυσε σημαντικά την απόκλιση μεταξύ των νευρογενετικών και ολιγοδενδρογενετικών ιδιοτήτων των NSCs in vitro. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι σημαντικές σε επίπεδο βασικής έρευνας και προσφέρουν εργαλεία για την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν τις συγκεκριμένες αποκλίσεις. Είναι γνωστό ότι τα αιμοπετάλια εκτός από την κύρια λειτουργία τους, την αιμόσταση, διαθέτουν επίσης πολλαπλές άλλες ιδιότητες, που διαμεσολαβούνται μέσω των παραγόντων που απελευθερώνουν έπειτα από ενεργοποίησή τους. Πρόσφατη ερευνητική δουλειά της ομάδας αποκάλυψε πως αιμοπεταλιακοί παράγοντες ευνοούν την επιβίωση των NSCs in vitro, ενώ η απομυελίνωση στο μεσολόβιο μυών επιφέρει συσσώρευση αιμοπεταλίων στα αιμοφόρα αγγεία της Υποεπενδυματικής ζώνης. Σε περιπτώσεις τραυματισμού ή εκφύλισης του εγκεφάλου τα αιμοπετάλια συμμετέχουν σε ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αποκρίσεις, χωρίς ωστόσο να είναι ξεκάθαρος ο ρόλος τους ως προς τα νευρικά βλαστικά/προγονικά κύτταρα. Με βάση τα παραπάνω και στοχεύοντας στη διερεύνηση παραγόντων του μικροπεριβάλλοντος με πιθανή προστατευτική και ρυθμιστική δράση ως προς τα νευρικά βλαστικά κύτταρα, σε δεύτερο επίπεδο, η παρούσα διατριβή εστίασε στη διερεύνηση του ρόλου των αιμοπεταλίων στη συμπεριφορά των NSCs, ενώ στηριζόμενοι στις παραπάνω in vitro παρατηρήσεις, δόθηκε έμφαση στις νευρογενετικές και ολιγοδενδρογενετικές ιδιότητες, με στόχο την προσέγγιση προστατευτικών στρατηγικών σε εκφυλιστικές καταστάσεις. Τα αποτελέσματά μας ανέδειξαν έναν προστατευτικό ρόλο των αιμοπεταλίων in vitro, καθώς η προσθήκη τους (απομονωμένων από νεαρά πειραματόζωα) στις καλλιέργειες, ενίσχυσε τόσο την αδιαφοροποίητη/προγονική κατάσταση των NSCs, επίδραση που διαπιστώθηκε να εξαρτάται από τις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις (cell-to-cell interactions) μεταξύ των δυο πληθυσμών, αλλά και την παρουσία των νευροβλαστών σε περιοχές με υψηλές κυτταρικές πυκνότητες (3D δομές), χωρίς όμως να επηρεάζει τα επίπεδα νευρογένεσης και ολιγοδενδρογένεσης. Από την άλλη πλευρά, η in vivo διερεύνηση σε ένα μοντέλο παροδικής χημικής απαλοιφής των αιμοπεταλίων της περιφέρειας, σε συνδυασμό με απομυελινωτική βλάβη στο μεσολόβιο, οδήγησε σε αυξημένη παρουσία ολιγοδενδρογλοιακών κυττάρων εντός της SEZ, καθώς και στο μεσολόβιο. Η απουσία συμβατής in vitro επίδρασης των αιμοπεταλίων ως προς την ολιγοδενδρογένεση, μπορεί να εξηγηθεί λαμβάνοντας υπόψιν ότι οι συγκαλλιέργειες αποτελούν ένα ιδιαίτερο και απλουστευτικό σύστημα σε σχέση με τις αλληλεπιδράσεις των κυτταρικών τύπων που εμφανίζονται εντός του εγκεφάλου. Επιπρόσθετα, είναι μια ένδειξη ότι η ρύθμιση του ολιγοδενδρογλοιακού χαρακτήρα δεν απαιτεί την άμεση επαφή αιμοπεταλίων/προγονικών κυττάρων, αλλά επιτυγχάνεται έμμεσα με τη διαμεσολάβηση άλλων κυτταρικών πληθυσμών, όπως για παράδειγμα του ενδοθηλίου. Τέλος, εξετάστηκε ο πιθανός ρόλος των αιμοπεταλίων σε μια άλλη κατάσταση νευροεκφύλισης και για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε βαρχυπρόθεσμη θρομβοκυτταροπενία σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο της νόσου Alzheimer (APP-PS1 μύες). Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο των παραγόντων του μικροπεριβάλλοντος στον καθορισμό των NSCs in vitro, αποκαλύπτοντας μια μεγαλύτερη εξάρτηση της νευρογένεσης και μια σημαντική ανθεκτικότητα της ολιγοδενδρογένεσης, ως προς την κυτταρική αρχιτεκτονική και κομβικούς παράγοντες εξωκυττάριας ουσίας. Επιπρόσθετα, υπογραμμίζουν την πολυδιάστατη ρυθμιστική δράση των αιμοπεταλίων, καθώς εμφανίζουν έναν ευνοϊκό ρόλο, ενισχύοντας την προγονική κατάσταση των NSCs in vitro, ενώ αντίθετα μια ανασταλτική δράση ως προς τα κύτταρα ολιγοδενδρογλοιακής μοίρας σε καταστάσεις απομυελίνωσης in vivo. Σημαντικό ρόλο σε αυτές τις διαδικασίες και διαφορικές επιδράσεις (άμεσες ή έμμεσες και θετικές ή αρνητικές) φαίνεται να διαδραματίζει ο αριθμός και η ποσότητα των αιμοπεταλίων που αλληλοεπιδρούν με τα βλαστικά και προγονικά κύτταρα, καθώς και τα εκάστοτε ερεθίσματα που λαμβάνουν τα αιμοπετάλια. Οι μεταμοσχεύσεις αυτών στο μεσολόβιο μυών υπό φυσιολογικές καταστάσεις ομοιόστασης και η διερεύνηση της συμπεριφοράς των νευρικών βλαστικών/προγονικών κυττάρων, θα συμβάλλει στη μεγαλύτερη κατανόηση της λειτουργικότητας και απόκρισης των αιμοπεταλίων, μεταξύ καταστάσεων ομοιόστασης και παθογένειας, παρέχοντας νέους πιθανούς στόχους για την ανάπτυξη μελλοντικών θεραπευτικών προσεγγίσεων σε εκφυλιστικές καταστάσεις του εγκεφάλου.
  • ItemOpen Access
    Ανάπτυξη συστήματος τεχνητής παραγωγής βιογενών ελευθέρων ριζών για την προσομοιωμένη μελέτη των οξειδωτικών τροποποιήσεων σε κρίσιμα βιομόρια σε συνδυασμό με την αντιοξειδωτική κατάσταση των διαφόρων βιολογικών συστημάτων
    (2023-10-30) Σκιπητάρη, Μαριάννα; Skipitari, Marianna
    Οι ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου (•OH) και σουπεροξειδίου (O2•−) είναι βασικές παράμετροι της πρόκλησης οξειδωτικού stress (ΟΣ) σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς. Συνεπώς, οι μελέτες για τη διερεύνηση in vitro των οξειδωτικών τους επιδράσεων σε βιολογικά συστήματα παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον στη Βιολογία, Ιατρική και Φαρμακευτική, αλλά και σε πολλές άλλες γνωστικές περιοχές όπως η Χημεία, η Φυσική και η Αστροβιολογία. Ωστόσο, η προσομοιωμένη μελέτη των in vitro επιδράσεων των •OH και O2•−, μέσω της εξειδικευμένης και ανεξάρτητα ελεγχόμενης in vitro παραγωγής τους δεν είναι εφικτή με τις υφιστάμενες μεθόδους (π.χ., της •OH με το σύστημα Fenton και της O2•− με το σύστημα οξειδάσης της ξανθίνης), διότι όχι μόνο δεν ελέγχουν τους ρυθμούς παραγωγής των •OH και O2•−, αλλά παράγουν/χρησιμοποιούν και άλλες παραμέτρους ΟΣ (π.χ. H2O2 από το σύστημα Fenton). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αναπτύχθηκε ένα σύστημα φωτοδιεγειρόμενων νανοσωματιδίων TiO2 (TiO2-NP) για την απολύτως ελεγχόμενη και εξειδικευμένη παραγωγή •OH και O2•−, σε μοριακή αναλογία 1:1, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί για in vitro βιολογικές προσομοιώσεις πρόκλησης υψηλού ΟΣ από αυτές τις ελεύθερες ρίζες. Ειδικότερα, το σύστημα TiO2-NP αναπτύχθηκε ώστε να παράγει •OH και O2•−, ταυτόχρονα ή μεμονωμένα, καθώς αυτές οι επιλογές προσομοιώνουν όλους τους in vivo συνδυασμούς παραγωγής τους. Επιπλέον, οι γνωστές μη ειδικές ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις του TiO2-NP με το H2O και διάφορα βιολογικά συστήματα (π.χ., κύτταρα, διαμεμβρανικές πρωτεΐνες) προσομοιώνουν τις εστιακές/ απομακρυσμένες αλληλεπιδράσεις οποιασδήποτε in vivo εστιακής πηγής •OH και O2•− με τους εξω/ενδοκυτταρικούς βιολογικούς τους στόχους, οι οποίες λαμβάνουν χώρα στο πυκνό κυτταρικό περιβάλλον. Για το σύστημα TiO2-NP αναπτύχθηκε ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο με σκοπό να είναι εφαρμόσιμο στα περισσότερα βιολογικά συστήματα. Οι ταχύτητες παραγωγής των •OH και O2•− από το σύστημα TiO2-NP ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση των εξειδικευμένων μορίων-ανιχνευτών τους τερεφθαλικό οξύ (TPA) και διυδροαιθίδιο (HE), αντίστοιχα, και συγκρίθηκαν με τον ρυθμό παραγωγής •OH από το σύστημα Fenton. Διαπιστώθηκε ότι η κινητική των αντιδράσεων •OH και O2•− με τα TPA και HE υπόκειται σε συναγωνισμό αλληλεπιδράσεων με την πηγή παραγωγής τους, το σύστημα TiO2-NP. Παρόμοια φαινόμενα συναγωνισμού πηγών δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species/ROS) με βιολογικούς στόχους είναι πολύ συνηθισμένα στα βιολογικά συστήματα, και ως εκ τούτου το σύστημα TiO2-NP παράλληλα αποτελεί προσομοιωτή τους με τα TPA/HE, κάτι που δεν διαπιστώθηκε κινητικά με το σύστημα Fenton. Το σύστημα TiO2-NP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την προσομοιωμένη μελέτη δοσο-εξαρτώμενων οξειδωτικών τροποποιήσεων στα επιμέρους βιολογικά συστήματα όλων των βιολογικών συστημάτων από τις •OH και O2•−. Αυτό συμπεραίνεται από το γεγονός ότι οι αναλογικοί γραμμικοί ρυθμοί παραγωγής •OH και O2•− (60 min και έως 8 min, αντίστοιχα) μπορούν να ελεγχθούν μεταβάλλοντας (α) τη συγκέντρωση TiO2, (β) την ενέργεια εκπομπής εκάστου των φωτονίων της φωτεινής πηγής και (γ) την ένταση του φωτός. Αντίθετα, η παραγωγή •OH από το σύστημα Fenton μεγιστοποιήθηκε σε ~5 sec ανεξάρτητα από τη μεταβολή της συγκέντρωσης Fe-II. Το σύστημα TiO2-NP, παράγοντας •OH και O2•−, δοκιμάστηκε ενδεικτικά σε αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA, πρότυπη υδρόφιλη πρωτεΐνη) και τη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL, δομική ομοιότητα με τα περισσότερα βιολογικά συστήματα, π.χ., κύτταρα, μεμβράνες, οργανίδια). Το σύστημα TiO2-NP προκάλεσε γραμμική αύξηση όλων των εξεταζόμενων οξειδωτικών τροποποιήσεων τόσο στην BSA όσο και στην LDL για έκθεση από 20 έως 40 min, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι κυρίως δοσο-εξαρτώμενες από την •OH. Αντίθετα, το σύστημα Fenton δεν εμφάνισε, δοσο-εξαρτώμενες από την •OH , τροποποιήσεις στη BSA. Επίσης, το σύστημα TiO2-NP χρησιμοποιήθηκε για την in vitro διερεύνηση της επίδρασης των •OH ή/και O2•−, στη δομή της ανθρώπινης ινσουλίνης (HI) (η οποία αξιολογήθηκε μέσω της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ), προσδιορίζοντας στη HI τον κατακερματισμό της και το σχηματισμό cross-links διτυροσίνης (Tyr-Tyr). Η έκθεση στην •OH, αλλά όχι στην O2•−, επηρέασε προοδευτικά τη δυνατότητα κρυστάλλωσης της HI, ενώ συσχετίστηκε αναλογικά με το σχηματισμό Tyr-Tyr και τη συσσωμάτωση της HI (με τον κατακερματισμό της σε πολύ μικρότερη έκταση). Εστιάζοντας στη δομής της HI, σε σχέση με την έκθεση στην •OH, δεν εντοπίστηκαν δομικές τροποποιήσεις των μορίων ή μεταβολές σε επιρρεπή στην οξείδωση αμινοξέα, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι οι κρύσταλλοι που μελετήθηκαν σχηματίστηκαν από μόρια που δεν έχουν υποστεί οξειδωτικές τροποποιήσεις.
  • ItemOpen Access
    Μελέτη νέων λειτουργιών της ταλίνης στη φυσιολογία και την παθοφυσιολογία του ενδοθηλίου
    (2023-10-23) Ρούνη, Γεωργία; Rouni, Georgia
    Απαραίτητη προϋπόθεση για την ομαλή λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση αλλά και στην ομοιοστασία των αγγείων αποτελεί η ρύθμιση των θέσεων κυτταρικής προσκόλλησης στην εξωκυττάρια μήτρα. Η δημιουργία και η αναδιοργάνωση των θέσεων κυτταρικής προσκόλλησης γίνεται μέσω ενός συμπλόκου δομικών και σηματοδοτικών πρωτεϊνών, που οργανώνεται μέσω των ιντεγκρινών διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, και ονομάζεται «συνδεόσωμα». Κύρια πρωτεΐνη του συνδεοσώματος αποτελεί η talin, η οποία παίζει καθοριστικό ρολό στην λειτουργία των αγγείων καθώς η έλλειψη της από τα ενδοθηλιακά κύτταρα οδηγεί σε πρώιμο εμβρυικό θάνατο. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τις θέσεις κυτταρικής προσκόλλησης, εστιάζοντας στη διαλεύκανση της λειτουργίας της talin στη φυσιολογία και παθοφυσιολογία του ενδοθηλίου. Μελετώντας το ρόλο της talin σε σταθερά προσκολλημένα κύτταρα αναδείχθηκε η καθοριστική της σημασία στην μηχανική κυτταρική απόκριση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Συγκεκριμένα δείξαμε ότι δυο υπο-περιοχές της talin πρωτεΐνης, η περιοχή της κεφαλής (talin head) και η περιοχής της ράβδου (talin rod) μεμονωμένα μπορούν να αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες του συνδεοσώματος, όπως η paxillin, η tensin και η Kank και να ρυθμίζουν την μεταγωγή των δυνάμεων, τη σταθεροποίηση των θέσεων κυτταρικής προσκόλλησης και τη διατήρηση της μορφολογίας των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, με τη χρήση της τεχνικής της πρωτεομικής ανάλυσης μελετήσαμε την οργάνωση του ενδοθηλιακού συνδεοσώματος. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν την talin ως κύριο ρυθμιστή των θέσεων κυτταρικής προσκόλλησης αφού η γενετική εξάλειψη της talin μειώνει την έκφραση όλων των πρωτεϊνών του συνδεοσώματος. Πολύ σημαντικό εύρημα είναι ο νέος ρόλος της talin σε μεταβολικά μονοπάτια, όπως της γλυκόλυσης. Επιπρόσθετα πρωτεομικές μελέτες απομονωμένων θέσεων κυτταρικής προσκόλλησης, αποκάλυψαν νέα μέλη του συνδεοσώματος στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα βρέθηκε η caprin-1, μια πρωτεΐνη που δεσμεύει RNA, να εντοπίζεται στις θέσεις κυτταρικής προσκόλλησης και να είναι εξαρτώμενη από την talin. Τέλος, δείξαμε πως η talin επηρεάζει την ακεραιότητα των διακυτταρικών συνδέσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων, και αποσαφηνίσαμε τον μοριακό μηχανισμό για το σύνδρομο συστηματικής τριχοειδούς διαρροής , μια σπάνια νόσο που έχει σαν χαρακτηριστικό την αγγειακή διαρροή, με απώτερο σκοπό την εφαρμογή νέων θεραπευτικών στόχων. Συνολικά η παρούσα διδακτορική διατριβή ενίσχυσε την επιστημονική γνώση για τη φυσιολογική λειτουργία των αγγείων και συνέβαλλε στην κατανόηση των μηχανισμών παθοφυσιολογίας του ενδοθηλίου που εμπλέκεται σε πληθώρα παθολογικών καταστάσεων.
  • ItemOpen Access
    Βελτίωση των ζυμωτικών ικανοτήτων στελεχών Saccharomyces cerevisiae που χρησιμοποιούνται στην οινοποιία μέσω προσαρμοστικής εργαστηριακής εξέλιξης
    (2023-09-29) Μαυρομμάτη, Μαρία; Mavrommati, Maria
    Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η απόκτηση νέων κυτταρικών πληθυσμών Saccharomyces cerevisiae με βελτιωμένες ζυμωτικές ικανότητες, μέσω μιας καινοτόμου εργαστηριακής τεχνικής, βασιζόμενης στις αρχές της φυσικής επιλογής, της Προσαρμοστικής Εργαστηριακής Εξέλιξης (Adaptive Laboratory Evolution- ALE). Χρησιμοποιήθηκαν τα χαρακτηρισμένα στελέχη S. cerevisiae CFB και S. cerevisiae BLR. Το πρώτο πείραμα ALE διενεργήθηκε με σκοπό την απόκτηση κυτταρικών πληθυσμών ανθεκτικότερων (σε σχέση με τα άγρια στελέχη) σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης. Πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες καλλιέργειες των κυττάρων σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 20 g/l γλυκόζη ακολουθούμενες από επιλογή υπό αυστηρή εξελικτική πίεση (1-3 h επώασης σε υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 18%, 23% ή 25% v/v αιθανόλης), κυκλικά για 150 και 200 γενεές, για τα στελέχη S. cerevisiae CFB και S. cerevisiae BLR, αντίστοιχα. Κατόπιν 100 γενεών εξέλιξης, ο εξελιγμένος πληθυσμός CFB επιβίωσε σε 25% v/v αιθανόλη για 4 h και ο εξελιγμένος πληθυσμός BLR σε 23% v/v αιθανόλη για 2 h. Και οι δύο εξελιγμένοι πληθυσμοί επέδειξαν βελτιωμένες ζυμωτικές ικανότητες σε σύγκριση με τα άγρια στελέχη σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 200 g/l γλυκόζη, περατώνοντας τη ζύμωση 166 h και 130 h νωρίτερα, αντίστοιχα, ενώ παρήγαγαν μέγιστες συγκεντρώσεις αιθανόλης 94,77 g/l και 98,67 g/l, σε σύγκριση με 84,91 g/l και 78,09 g/l των αγρίων στελεχών, αντίστοιχα. Σε πραγματικές συνθήκες οινοποίησης σε γλεύκη Ασύρτικου και Ροδίτη, τα άγρια στελέχη σε όλες τις περιπτώσεις ολοκλήρωσαν τη ζύμωση νωρίτερα από τους πληθυσμούς 100 γενεών εξέλιξης (20 h έως 428 h νωρίτερα), ενώ οι εξελιγμένοι πληθυσμοί στην πλειονότητα των περιπτώσεων είχαν μεγαλύτερη απόδοση σε αιθανόλη. Ο αυξημένος χρόνος ζύμωσης των εξελιγμένων πληθυσμών οφειλόταν στο χρόνο κατανάλωσης της φρουκτόζης του γλεύκους, ο οποίος ήταν σε όλες τις περιπτώσεις πολύ μεγαλύτερος (κατά 70-336 h) του χρόνου αφομοίωσης της γλυκόζης. Οι συγκεντρώσεις των περισσοτέρων πτητικών ενώσεων των οίνων οι οποίοι προέκυψαν από τα άγρια στελέχη και τους εξελιγμένους κυτταρικούς πληθυσμούς ήταν διαφορετικές μεταξύ τους. Το δεύτερο πείραμα ALE είχε ως στόχο την απόκτηση νέων κυτταρικών πληθυσμών S. cerevisiae, ανθεκτικότερων στην αιθανόλη, οι οποίοι ταυτοχρόνως θα έχουν τη δυνατότητα να αφομοιώνουν αποτελεσματικότερα τη φρουκτόζη. Για την υλοποίηση αυτού του στόχου πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες καλλιέργειες σε θρεπτικό υλικό με 20 g/l φρουκτόζη, ακολουθούμενες από επιλογή για 3 h σε υδατικό διάλυμα συγκέντρωσης 18% v/v αιθανόλης, κυκλικά για 100 γενεές. Σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 200 g/l φρουκτόζη, το άγριο στέλεχος CFB, ο πληθυσμός CFB 100 γενεών εξέλιξης και ο πληθυσμός BLR 100 γενεών εξέλιξης άφησαν αζύμωτες ποσότητες φρουκτόζης 54,27 g/l μετά από 2100 h επώασης, 17,54 g/l μετά από 2100 h επώασης και 11,99 g/l μετά από 2000 h επώασης, αντίστοιχα, ενώ το άγριο στέλεχος BLR περάτωσε τη ζύμωση σε 400 h. Σε συνθετικό θρεπτικό μέσο με 100 g/l γλυκόζη και 100 g/l φρουκτόζη (προσομοίωση γλεύκους) το άγριο στέλεχος CFB άφησε αζύμωτες ποσότητες γλυκόζης και φρουκτόζης 8,76 g/l και 36,31 g/l, αντίστοιχα μετά από 1000 h επώασης, ο πληθυσμός CFB εξελιγμένος για 150 γενεές σε γλυκόζη ολοκλήρωσε τη ζύμωση σε 495 h και ο πληθυσμός CFB εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη την ολοκλήρωσε σε 170 h. Το άγριο στέλεχος BLR, ο πληθυσμός BLR εξελιγμένος για 200 γενεές σε γλυκόζη και ο πληθυσμός BLR εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη περάτωσαν τη ζύμωση σε 354 h, 312 h και 436 h, αντίστοιχα. Οι διαφορετικές ζυμωτικές συμπεριφορές επιβεβαιώθηκαν από τις κινητικές παραμέτρους που ελήφθησαν μετά από προσαρμογή του μαθηματικού μοντέλου Aiba στα πειραματικά δεδομένα. Σε πραγματικές συνθήκες οινοποίησης σε γλεύκος Ασύρτικου, το άγριο στέλεχος CFB και ο εξελιγμένος πληθυσμός 150 γενεών σε γλυκόζη, ολοκλήρωσαν τη ζύμωση σε 140 h, καταναλώνοντας ταυτόχρονα τη γλυκόζη και τη φρουκτόζη του γλεύκους και ο εξελιγμένος πληθυσμός CFB 100 γενεών σε φρουκτόζη την ολοκλήρωσε σε 236 h και κατανάλωσε τη γλυκόζη 71 h νωρίτερα από τη φρουκτόζη. Το άγριο στέλεχος BLR οδήγησε το γλεύκος σε πλήρη ξηρότητα στις 165 h, έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 25 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη, ο εξελιγμένος πληθυσμός 200 γενεών σε γλυκόζη το οδήγησε σε πλήρη ξηρότητα σε 380 h έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 144 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη και ο πληθυσμός εξελιγμένος για 100 γενεές σε φρουκτόζη κατανάλωσε και τα δύο σάκχαρα σε 236 h έχοντας καταναλώσει τη γλυκόζη 50 h νωρίτερα από ό,τι τη φρουκτόζη. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών παραχθέντων οίνων παρατηρήθηκαν σε επτά αλκοόλες, πέντε εστέρες και πέντε οξέα. Οι εν λόγω διαφορές επιβεβαιώθηκαν μερικώς από τον οργανοληπτικό έλεγχο των οίνων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή φιλοδοξεί να συμβάλει στην ευρύτερη εφαρμογή της εργαστηριακής εξέλιξης (ALE) τόσο στη βιομηχανία παραγωγής βιοαιθανόλης, όσο και στην οινοποιία, με στόχο την απόκτηση νέων στελεχών ζυμομυκήτων με βελτιωμένες ιδιότητες.
  • ItemOpen Access
    Ανάπτυξη κλινικών δεικτών αξιόπιστης εκτίμησης κινδύνου για εμφάνιση αθηροσκληρωτικών νόσων στον άνθρωπο
    (2023-10) Παπαδέα, Πολυξένη; Papadea, Polyxeni
    Η παρούσα διδακτορική διατριβή οδήγησε στην ανάπτυξη απλών και καινοτόμων μεθοδολογιών για την απομόνωση, το χαρακτηρισμό και την κλασμάτωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL) στα κύρια μοριακά τους συστατικά. Απώτερος σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη σε αυτά συγκεκριμένων οξειδωτικών τροποποιήσεων οι οποίες χαρακτηρίζουν τα, αιτιακώς σχετιζόμενα με την ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών και άρα και με τον κίνδυνο εμφάνισης των επακόλουθων καρδιαγγειακών παθήσεων , οξειδωμένα LDL (oxLDL) σωματίδια. Οι αναπτυχθείσες στην παρούσα διατριβή μέθοδοι περιλαμβάνουν: (α) Μία απλή, σχετικά γρήγορη και χαμηλού κόστους μέθοδο για την απομόνωση των LDL σωματιδίων (LDL-P) από τον ορό του αίματος, προς αποφυγή των μειονεκτημάτων των έως τώρα εφαρμοζόμενων υπερφυγοκεντρικών μεθόδων και μεθόδων χρωματογραφίας συγγένειας. (β) Επιβεβαίωση της καθαρότητας των απομονωμένων με την προτεινόμενη μεθοδολογία LDL, μέσω SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης της πρωτεΐνης αυτών (απολιποπρωτεΐνη Β100, apoB100), και προσδιορισμός του μεγέθους των LDL-P. Το τελευταίο καθώς και η συγκέντρωση των LDL-P στον ορό υπολογίζονται στην παρούσα διατριβή μέσω μίας αναπτυχθείσας απλής, κλινικά εφαρμόσιμης μεθόδου - σε σύγκριση με τις υπάρχουσες μεθοδολογίες μαγνητικού πυρηνικού συντονισμού (NMR) – ενώ αξιολογείται και η αξία τους ως δείκτες εκτίμησης του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών παθήσεων. (γ) Μία μέθοδος για την κλασμάτωση των LDL, για πρώτη φορά, στα επιμέρους πρωτεϊνικά/λιπιδικά (apoB100, εστέρες χοληστερίνης, τριγλυκερίδια, ελεύθερη χοληστερίνη, φωσφολιπίδια) και αντιοξειδωτικά (καροτενοειδή, τοκοφερόλες) συστατικά τους. (δ) Μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση, για πρώτη φορά, ορισμένων συγκεκριμένων - αντιπροσωπευτικών των αρχικών επιδράσεων του οξειδωτικούς στρες - οξειδωτικών τροποποιήσεων/δεικτών στα μοριακά συστατικά των LDL (cholesteryl ester-OOH, triglyceride-OOH, free cholesterol-OOH, phospholipid-OOH, apoB100-MDA, apoB100-DiTyr) εκ των πολλών (γνωστών/άγνωστων/υπό ανάπτυξη) οξειδωτικών τροποποιήσεων που συλλογικά χαρακτηρίζουν την οξειδωτική κατάσταση των oxLDL. Οι μέθοδοι αυτοί έρχονται σε αντίθεση με τις υπάρχουσες μη-εξειδικευμένες και αναξιόπιστες μεθόδους για την αξιολόγηση της οξειδωτικής κατάστασης των oxLDL. Οι προαναφερθέντες oxLDL δείκτες μελετώνται για πρώτη φορά σε ασθενείς επιρρεπείς στην εμφάνιση και σε ασθενείς με εγκατεστημένες αθηρωματικές πλάκες και καρδιαγγειακές νόσους. Συγκεκριμένα, οι ομάδες ασθενών που επιλέχθηκαν είναι: ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο υπό αιμοκάθαρση, ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο υπό περιτοναϊκή κάθαρση, ασθενείς με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής και ασθενείς με στένωση καρωτίδων. Επιπροσθέτως, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε δομική μελέτη της apoB100 των LDL σωματιδίων, καθώς αυτή αποτελεί μέχρι και σήμερα μία πρωτεΐνη ελάχιστα μελετημένη και με άγνωστη δομή. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός των βιοφυσικών ιδιοτήτων του διαλύματος της apoB100 μέσω μελέτης της δευτεροταγούς της δομής (με ανάλυση κυκλικού διχρωισμού, CD analysis), της θερμικής της σταθερότητας (με διαφορική φθορισμομετρία σάρωσης, nanoDSF) και της ύπαρξης συσσωματωμάτων στο διάλυμα αυτής (μέσω δυναμικής σκέδασης φωτός, DLS). Έπειτα, ακολούθησαν δοκιμές LCP (Liquid Cubic Phase) κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης και μέτρηση των προκύψαντων κρυστάλλων με περίθλαση ακτίνων Χ. Συνοψίζοντας, η απομόνωση των LDL σωματιδίων και η κλασμάτωσή τους στα επιμέρους πρωτεϊνικά, λιπιδικά και αντιοξειδωτικά συστατικά τους ανοίγει το δρόμο για μελλοντικές μελέτες διερεύνησης και ποσοτικοποίησης όλων των πιθανών οξειδωτικών τροποποιήσεων των LDL και συνεπώς του πλήρους χαρακτηρισμού της, άγνωστης μέχρι σήμερα, οξειδωτικής κατάστασης των oxLDL σωματιδίων. Το γεγονός αυτό μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω μελέτες ταυτοποίησης των οξειδωτικών τροποποιήσεων των oxLDL οι οποίες αναγνωρίζονται από τα μακροφάγα και είναι υπεύθυνες για τη μετατροπή των τελευταίων σε αφρώδη κύτταρα, τα οποία ευθύνονται για το σχηματισμό των αθηρωματικών πλακών που με τη σειρά τους οδηγούν στην εμφάνιση των καρδιαγγειακών παθήσεων. Τέλος, ο βιοφυσικός χαρακτηρισμός και οι δοκιμές LCP κρυστάλλωσης της apoB100, που πραγματοποιήθηκαν για πρώτη φορά στην υπάρχουσα βιβλιογραφία στην παρούσα διατριβή, αποτελούν το έναυσμα για την πραγματοποίηση περαιτέρω μελετών κρυστάλλωσης της apoB100 με στόχο την επίλυση της, άγνωστης μέχρι σήμερα, δομής αυτής και της διαλεύκανσης της λειτουργίας και του ρόλου της στην ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών.
  • ItemOpen Access
    Δομική μελέτη βιολογικών μακρομορίων για τη δημιουργία φαρμακευτικών στόχων
    (2023-05-31) Σπηλιοπούλου, Μαρία; Spiliopoulou, Maria
    Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη συνδυαστική χρήση βιοχημικών μεθόδων και τεχνικών ακτίνων Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος προς την κατεύθυνση του σχεδιασμού και της ανάπτυξης φαρμακευτικών στόχων. Τα μόρια που μελετήθηκαν παρουσιάζουν ένα εύρος μεγεθών, από πεπτίδια έως πρωτεΐνες. Αναφορικά με τα πεπτίδια, τα συνθετικά ανάλογα ορμονών και η εφαρμογή τους ως πιθανά φάρμακα μελετώνται εκτενώς λόγω της κλινικής τους χρήσης. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκε το οκταπεπτίδιο οκτρεοτίδη (octreotide), που αποτελεί ένα πεπτιδικό ανάλογο της σωματοστατίνης. Παρόλο που το octreotide διατίθεται ήδη στο εμπόριο ως άμορφο εναιώρημα για υποδόρια ή ενδοφλέβια έγχυση, ένα προϊόν σε μικροκρυσταλλική μορφή που παρουσιάζει αυξημένη ενζυμική σταθερότητα και παρατεταμένο χρόνο δράσης θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Προς αυτή την κατεύθυνση, η διερεύνηση των κρυσταλλικών πολυμόρφων του πεπτιδίου από πλευράς ταυτοποίησης και δομικού χαρακτηρισμού είναι εξαιρετικά σημαντική. Τα επιτυχή πειράματα κρυστάλλωσής του ακολούθησε ο πλήρης δομικός του χαρακτηρισμός από δεδομένα περίθλασης ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (X-ray powder diffraction, XRPD), οδηγώντας σε ένα υψηλής ευκρίνειας (1.87 Å) δομικό μοντέλο (PDB ID: 6vc1), αποκαλύπτοντας τις δομικές ιδιότητες του μορίου το οποίο συμφωνεί στερεογεωμετρικά με τις δομές του octreotide που είχαν προσδιοριστεί σε προηγούμενες μελέτες, ενώ επισημαίνονται κάποιες διαφορές, λόγω της βελτιωμένης ευκρίνειας του χάρτη ηλεκτρονικής πυκνότητας. Επίσης, μελετήθηκε το φαρμακευτικό πεπτίδιο λιραγλουτίδη (liraglutide) που αποτελεί ανάλογο του παρόμοιου με τη γλυκαγόνη πεπτιδίου 1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), χημικά τροποποιημένο με την προσθήκη του παλμιτικού οξέος, το οποίο συνδέεται αντιστρεπτά με την αλβουμίνη του πλάσματος έχοντας παρατεταμένο χρόνο δράσης. Οι in silico μελέτες μοντελοποίησης και τα πειράματα ελέγχου της μεταβολής της θερμοφορητικής κίνησης και του διαφορικού φθορισμού επιβεβαίωσαν την αλληλεπίδραση της αλβουμίνης με το liraglutide. Ωστόσο, η αδυναμία δημιουργίας κρυστάλλων για το σύμπλοκο αυτό, κατευθύνει τις επόμενες μελέτες στη διερεύνηση της διαδικασίας δημιουργίας του συμπλόκου και των συνθηκών κρυστάλλωσης. Σχετικά με τις πρωτεΐνες που εξετάζονται δομικά στη συγκεκριμένη εργασία, πραγματοποιήθηκε εκτενής μελέτη του πολυμορφισμού της ανθρώπινης ινσουλίνης, παρουσία δύο οργανικών μορίων-προσδετών (4-chlororecorcinol, 4-bromorecorcinol) σε ένα εύρος τιμών pH. Η πρόσδεση των μορίων στην ινσουλίνη ταυτοποιήθηκε με πειράματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού διαφορικής μεταφοράς κορεσμού (STD-NMR). Η δομική συμπεριφορά του μορίου καταγράφηκε τόσο μέσω πειραμάτων XRPD, για την ανίχνευση των διαφορετικών πολυμόρφων, όσο και με πειράματα περίθλασης ακτίνων Χ από μονοκρυστάλλους (single crystal X-ray diffraction, SCXRD), για τον ακριβή προσδιορισμό των θέσεων και αλληλεπιδράσεων των προσδετών. Εντοπίσθηκαν τέσσερα πολύμορφα μονοκλινούς συμμετρίας, ένα εκ των οποίων δεν έχει καταγραφεί έως τώρα βιβλιογραφικά για την ανθρώπινη ινσουλίνη, αποδεικνύοντας το πιο πυκνά πακεταρισμένο πολύμορφο για την πρωτεΐνη συγκρυσταλλωμένη με τους δύο αυτούς προσδέτες, κάτι ιδιαίτερα σημαντικό προς την κατεύθυνση της δημιουργίας πολυκρυσταλλικών φαρμάκων. Τα αποτελέσματα δείχνουν την αποτελεσματικότητα μιας νέας προσέγγισης που συνδυάζει τεχνικές φασματοσκοπίας και περίθλασης και παρέχει μια καινοτόμο εναλλακτική λύση για την υψηλής απόδοσης μελέτη της ινσουλίνης. Το επόμενο κεφάλαιο αφορά στη μελέτη πρωτεϊνικών μορίων με κομβικό ρόλο κατά τη διάρκεια ιϊκών κύκλων ζωής, καθώς χαρακτηρίζονται ως κατάλληλοι στόχοι για την ανάπτυξη αντιϊκών φαρμάκων. Οι μελέτες εστίασαν σε δύο οικογένειες ιών, τους Arenaviridae και τους Picornaviridae. Στην πρώτη περίπτωση, περιγράφεται ο μηχανισμός δράσης και πολυμερισμού της νουκλεοπρωτεΐνης, με χρήση βιοπληροφορικών μέσων και δεδομένων ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Επίσης, αναλύεται η παραγωγή, ο έλεγχος σταθερότητας και ενεργότητας και ο δομικός χαρακτηρισμός της περιοχής εξωνουκλεάσης της, απουσία και παρουσία της «βασικής θηλιάς», με απώτερο στόχο τη μελέτη της ποικιλίας των επεκτάσεων των δομικών μοτίβων που εμπλέκονται στον τρόπο πρόσδεσης μεταξύ μορίων νουκλεοπρωτεΐνης και την αξιολόγηση των κύριων λειτουργικών επιπτώσεων των αλληλεπιδράσεων, καθώς και του ρόλου της εξωνουκλεασικής περιοχής, καθιστώντας τη νουκλεοπρωτεΐνη στόχο επιλογής για μελλοντικά εμβόλια και αντιϊκές θεραπείες. Η δεύτερη περίπτωση ιϊκής πρωτεΐνης αφορά στην πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie. Συγκεκριμένα, περιγράφεται η πορεία των πειραμάτων έκφρασης, απομόνωσης και κρυστάλλωσης της εν λόγω πρωτεΐνης, ενώ πραγματοποιήθηκε μια εκτενής μελέτη διαλογής δομικών θραυσμάτων, στοχεύοντας στην ανίχνευση αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης με μικρά μόρια. Η εύρεση μορίων που είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με την πρωτεΐνη με τρόπο που να επηρεάζεται η λειτουργία της είναι ένα από τα πρώτα βήματα στο σχεδιασμό ενώσεων που προορίζονται για τη θεραπεία της παθολογίας που προκαλεί ο ιός. Μέσω διαδικασιών βελτιστοποίησης, τα μόρια αυτά μπορούν να αποτελέσουν συστατικό υποψήφιων φαρμάκων για τη θεραπεία αυτής της νόσου. Οι δομικές πληροφορίες που εξάγονται για χημικά μόρια που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό ενώσεων που παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα δράσης έναντι μοριακών στόχων. Το τελευταίο κεφάλαιο σχετίζεται με την ανάπτυξη μεθοδολογιών για τη δομική βιοχημεία, εστιάζοντας στη δομική μελέτη της παγκρεατικής ελαστάσης του χοίρου. Πρόκειται για την αξιοποίηση των πλεονεκτημάτων που προσφέρει η μέθοδος Rietveld για τη βελτιστοποίηση της δομής, εκμεταλλευόμενοι την ανισοτροπική αλλαγή που προκαλούν στο κρυσταλλικό πλέγμα οι μεταβολές θερμοκρασίας. Πολυκρυσταλλικά δείγματα της ελαστάσης μετρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και κρυογονικές θερμοκρασίες και τα δεδομένα περίθλασης αξιοποιήθηκαν με απώτερο στόχο τον πλήρη δομικό χαρακτηρισμό του μορίου. Τα αποτελέσματα δείχνουν την επέκταση των ορίων της μεθόδου XRPD, για τη βελτιστοποίηση δομών μακρομορίων μεγάλου αριθμού αμινοξέων. Για τη συλλογή δεδομένων XRPD χρησιμοποιήθηκε μια ποικιλία εξοπλισμού και οργάνων, ενώ παρουσιάζεται σύγκριση των συλλεχθέντων δεδομένων ανά περιπτώσεις. Ο πρωταρχικός έλεγχος των πολυκρυσταλλικών δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση εργαστηριακών περιθλασιμέτρων και ακολούθησε συλλογή υψηλής ευκρίνειας δεδομένων περίθλασης στον ερευνητικό σταθμό ID22 του Ευρωπαϊκού σύγχροτρον ESRF, ενώ μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και στον ερευνητικό σταθμό MS-X04SA του Ελβετικού σύγχροτρον (SLS), με τη χρήση του καινοτόμου ανιχνευτή MYTHEN II, που ανά περιπτώσεις βελτίωσε δραματικά την ευκρίνεια των δεδομένων περίθλασης. Τέλος, τα πειράματα SCXRD πραγματοποιήθηκαν κυρίως στους ερευνητικούς σταθμούς κρυσταλλογραφίας μακρομορίων (14.1, 14.2 & P13, P14) του σύγχροτρον BESSY II στο Ινστιτούτο Helmholtz του Βερολίνου και του Γερμανικού σύγχροτρον (DESY), αντίστοιχα. Εν κατακλείδι, η συνδυαστική χρήση διαφόρων τεχνικών περίθλασης ακτίνων-Χ για τη συστηματική διερεύνηση της δομικής συμπεριφοράς των μακρομορίων σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών, παρέχοντας κρίσιμες πληροφορίες για τη λειτουργία και τις ιδιότητές τους, είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική, κάτι που αποδεικνύεται από τα ευρήματα και τις παρατηρήσεις της παρούσας διατριβής.
  • ItemOpen Access
    Αναπτυξιακοί μηχανισμοί κατά τη μορφογένεση της παρεγκεφαλίδας στον οργανισμό-μοντέλο Gallus domesticus
    (2023-02-22) Κομματά, Βασιλική; Kommata, Vasiliki
    Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι παράμετροι που εμπλέκονται στη διαμόρφωση της ελίκωσης του παρεγκεφαλιδικού φλοιού. Αρχικά βρέθηκε ότι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κοκκωδών κυττάρων της EGL ζώνης (κύρια ζώνη πολλαπλασιασμού των κυττάρων στην αναπτυσσόμενη παρεγκεφαλίδα) αποτελεί έναν βασικό μηχανισμό διαμόρφωσης των ελικώσεων. Συγκεκριμένα, ο υψηλότερος ρυθμός πολλαπλασιασμού των κοκκωδών κυττάρων στην κορυφή συγκριτικά με τη βάση του αναπτυσσόμενου λοβού, ευθύνεται για την προς την έσω ελίκωση του παρεγκεφαλιδικού φλοιού και την ταυτόχρονη αύξηση του λοβού. Παράλληλα, φάνηκε ότι η στιβάδα των κυττάρων Purkinje εμπλέκεται στο σχηματισμό των λοβών με ταυτόχρονη αλλαγή στη μορφολογία (επιμήκυνση) των κοκκωδών κυττάρων και συσσώρευσή τους στα ‘κέντρα αγκίστρωσης’. Ακολούθως, μελετήθηκε η εμπλοκή κάποιων πρωτεϊνών (π.χ. αυξητικοί παράγοντες, διαμεμβρανικές πρωτεΐνες) στην τελική διαμόρφωση των ελικώσεων του παρεγκεφαλιδικού φλοιού. Παρατηρήθηκε εμπλοκή του αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη στον πολλαπλασιασμό, την ωρίμανση και τη μετανάστευση των κοκκωδών κυττάρων της EGL ζώνης, ειδικότερα στις κορυφές των αναπτυσσόμενων λοβών. Επίσης, διαπιστώθηκε η συμμετοχή του διαμεμβρανικού υποδοχέα ιντεγκρίνη στην τελική διαμόρφωση της ελίκωσης του παρεγκεφαλιδικού φλοιού καθώς παρατηρήθηκε διαφορετικό πρότυπο έκφρασης στις κορυφές του αναπτυσσόμενου λοβού συγκριτικά με τα τοιχώματα και τις βάσεις. Ένα επιπλέον μόριο που μελετήθηκε και φαίνεται να συμμετέχει είναι το ενδιάμεσο ινίδιο βιμεντίνη που εκφράζεται στα γλοιακά κύτταρα. Το χωροχρονικό πρότυπο έκφρασης της βιμεντίνης καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης υποδεικνύει ότι τα κύτταρα της ακτινωτής γλοίας παίζουν καθοριστικό ρόλο στην οργάνωση της στιβαδωτής δομής του φλοιού της παρεγκεφαλίδας, καθώς οι ίνες της ακτινωτής γλοίας παρέχουν ένα ικρίωμα για τη μετανάστευση των κοκκωδών κυττάρων της EGL ζώνης πολλαπλασιασμού. Τέλος, διερευνήθηκε η συμμετοχή του γλουταμινικό οξέος και του νευροτροποποιητή μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) στη διαμόρφωση του παρεγκεφαλιδικού φλοιού. Φαρμακευτική αναστολή των AMPA υποδοχέων του γλουταμινικού οξέος με τη χρήση του αναστολέα CNQX, δεν έδειξε κάποια σημαντική επίδραση στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κοκκωδών κυττάρων της EGL ζώνης. Αντίθετα, φαρμακευτική αναστολή της νευρωνικής συνθάσης του ΝΟ, με τη χρήση του L-NAME, αποκάλυψε ότι το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο, επηρεάζει διαφορετικά τον πολλαπλασιασμό των κοκκωδών κυττάρων της EGL, έχοντας σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του ρυθμού νευρογένεσης στον εμβρυικό εγκέφαλο όρνιθας. Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης προτείνουν το ρόλο του ΝΟ, της βιμεντίνης, ιντεγκρίνης και της πλειοτροπίνης στην κυτοαρχιτεκτονική οργάνωση και ελίκωση της εμβρυικής παρεγκεφαλίδας μέσω σύνθετων μηχανισμών που σχετίζονται τον ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού στην EGL και την μετανάστευση των κοκκωδών κυττάρων.
  • ItemOpen Access
    Μελέτη της εκδήλωσης αγχώδους συμπεριφοράς σε ζωικό μοντέλο Πάρκινσον. Διερεύνηση των νευροχημικών μηχανισμών στο μεταιχμιακό σύστημα του εγκεφάλου σε συνδυασμό με τη νευροπροστατευτική δράση φυσικών φαινολικών συστατικών
    (2023-02-27) Τσαρούχη, Μάρθα; Tsarouchi, Martha
    Οι νευροεκφυλιστικές παθήσεις, είτε κληρονομικές είτε σποραδικές, χαρακτηρίζονται από προοδευτική δυσλειτουργία του νευρικού συστήματος που σχετίζεται με ατροφία εγκεφαλικών περιοχών του μεταχμιακού συστήματος. Η νόσος του Πάρκινσον (PD) αποτελεί μία από τις πιο συχνές νευροεκφυλιστικές παθήσεις του Κ.Ν.Σ με χρόνια και προοδευτικά εξελισσόμενη πορεία κινητικών διαταραχών, που τα τελευταία χρόνια συσχετίζεται με συναισθηματικές και γνωσιακές διαταραχές. Οι διαταραχές της διάθεσης και ιδιαίτερα η κατάθλιψη καθώς και οι αγχώδεις διαταραχές αποτελούν συχνή συν-νοσηρότητα των ασθενών με PD, προτείνοντας ένα κοινό νευροανατομικό υπόβαθρο στο φλοίο-μεταιχμιακό σύστημα. Νευροχημικοί μηχανισμοί που ευθύνονται για τις μη-κινητικές διαταραχές, τις νοητικές και συναισθηματικές λειτουργίες στην PD έχουν συσχετισθεί με μεταβολές νευροδιαβιβαστικών συστημάτων όπως είναι αυτό της σεροτονίνης και της νοραδρεναλίνης. Επίσης, προτείνεται ότι τόσο η φλεγμονώδης αιτιολογία της PD αλλά και η αλλοστατική έκφραση νευροτροφικών παραγόντων εμπλέκονται στην εκδήλωση αγχωδών διαταραχών έπειτα από εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλανας ουσίας. Η υπάρχουσα φαρμακευτική αγωγή δεν παρέχει μακροχρόνια αποτελεσματική διαχείρηση των συμπτωμάτων της νόσου και τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί η διατροφική αξία φυτοχημικών ουσιών προκειμένου να κατανοηθούν οι μηχανισμοί της πιθανής νευροπροστατευτικής επίδρασης της συμπληρωματικής διατροφής που είναι πλούσια σε φαινολικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένης της Κορινθιακής σταφίδας (Vitis vinifera L. var Apyrena). Οι πολυφαινόλες που αποτελούν ομάδα φυτοχημικών παρουσιάζουν πληθώρα ευεργετικών δράσεων για την υγεία. Μεταξύ άλλων επιδεικνύουν αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αγγειοδιασταλτικές και αντιθρομβωτικές ιδιότητες. Συγκεκριμενα στην Κορινθιακή σταφίδα έχουν ταυτοποιηθεί απλές φαινολικές ενώσεις και φλαβονοειδή όπως κερκετίνη, καμπφερόλη, ρεσβερατρόλη και 3-Ο-γλυκοζίτες ανθοκυανιδινών. Στο πλαίσιο της παρούσας Διατριβής, ερευνητικό ερώτημα αποτέλεσαν οι νευροχημικές μεταβολές, ο ρόλος προ-φλεγμονωδών παραγόντων καθώς και η κατανόηση των μηχανισμών της πιθανής νευροπροστατευτικής δράσης της συμπληρωματικής διατροφής πλούσιας σε φαινολικά συστατικά, όπως η Κορινθιακή σταφίδα (Vitis vinifera L. var Apyrena). Για τη διερεύνηση των νευροβιολογικών μηχανισμών που υπογραμμίζουν την εκδήλωση μη-κινητικών διαταραχών στην PD καθώς και τον ρόλο των πολυφαινολών χρησιμοποιήθηκαν ως ζωικό πρότυπο αρσενικοί ενήλικοι Wistar επίμυες. Το ζωικό μοντέλο της PD αναπτύχθηκε σε πειραματικές ομάδες που έλαβαν υποδόρια ενέσεις της νευροτοξίνης ροτενόνη για 28 ημέρες σε συγκέντρωση 2,5 mg/kg. Οι ομάδες παρέμβασης έλαβαν συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα, ενώ υπήρχαν και οι αντίστοιχες ομάδες ελέγχου (με έκδοχο νευροτοξίνης και ροτενόνης-ζώων) χωρίς την διατροφική παρέμβαση. Η κινητική συμπεριφορά καθώς και η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων χαρακτήρισε τον φαινότυπο που ομοιάζει με PD. Στην παρούσα μελέτη επιπλέον διερευνήθηκε η εκδήλωση αγχώδους συμπεριφοράς με δοκιμασίες ανοιχτού πεδίου (Open Field) και υπερυψωμένου λαβυρίνθου σχήματος «+» (Elevated Plus Maze). Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν νευροχημικές μελέτες με στόχο τον συσχετισμό της εκφύλισης των ντοπαμινεργικών νευρώνων με τη νοραδρενεργική και σεροτονινεργική διαβίβαση σε εγκεφαλικές περιοχές που εμπλέκονται στον έλεγχο συναισθημάτων και συγκεκριμένα σε αυτές του μεταιχμιακού συστήματος, όπως ο προμετωπιαίος και ο κογχομετωπιαίος φλοιός, ο ιππόκαμπος και ο βασικός και έξω αμυγδαλοειδής πυρήνας. Εξετάστηκαν δείκτες της νοραδρενεργικής διαβίβασης, όπως οι β2 αδρενεργικοί υποδοχείς και της σεροτονεργικής διαβίβασης με επίκεντρο την σεροτονίνη (5-ΗΤ) και τον μεταφορέα της σεροτονίνης (SERT), με μεθόδους ανοσοϊστοχημείας, διπλού ανοσοφθορισμού και Western Blot. Παράλληλα, στα πλαίσια της γλουταμινεργικής διαβίβασης, διερευνήθηκε η αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης της NR2B (NMDAε2) υπομονάδας του NMDA υποδοχέα και της μετασυναπτικής πρωτεΐνης PSD95. Σε επόμενο στάδιο πραγματοποιήθηκε μελέτη των επιπέδων έκφρασης του νευροτροφικού παράγοντα BDNF και της προφλεγμονώδους κυτοκίνης IL-1β στις υπό μελέτη περιοχές του φλοιο-μεταιχμιακού κυκλώματος επίμυων που έλαβαν ροτενόνη ή έκδοχο με ή χωρίς συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας Διατριβής, η ντοπαμινεργική δυσλειτουργία στη μελαινοραβδωτή οδό σε πειραματικό ζωικό μοντέλο ροτενόνης συνοδεύτηκε από αγχώδη φαινότυπο που διαπιστώθηκε ότι σχετίζεται με μεταβολές στους β2-ARs, την 5-ΗΤ, τον SERT, τον BDNF και την IL-1β σε περιοχές του φλοιο-μεταιχμιακού συστήματος εγκεφάλου επίμυος. Στην παρούσα μελέτη, η συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα αποκατέστησε εν μέρει τα κινητικά καθώς επίσης και τα μη κινητικά ελλείμματα. Σε κοινό πλαίσιο, η συμπληρωματική διατροφή με Κορινθιακή σταφίδα αποκατέστησε εν μέρει τις επαγόμενες από τη ροτενόνη αλλαγές στους β2-ARs και διέσωσε εν μέρει την πυκνότητα των κυττάρων 5-ΗΤ+ και BDNF+. Συνολικά με βάση την υπόθεση της εργασίας, της παρούσας Διατριβής προτείνονται ως πιθανοί παθοφυσιολογικοί νευροχημικοί μηχανισμοί στην εκδήλωση αγχωδών συναισθηματικών διαταραχών οι μεταβολές στη σεροτονινεργική διαβίβαση στο φλοίο-μεταιχμικό κύκλωμα και επίσης αναδεικνύεται η μερική «(πολυ)φαινολική νευροπροστασία» σε νευρικά κυκλώματα που ελέγχουν κινητικές και συναισθηματικές λειτουργίες.
  • ItemOpen Access
    Νευροβιολογικοί μηχανισμοί και επιγενετική ρύθμιση των διαταραχών της κοινωνικής συμπεριφοράς
    (2023-02-24) Περδικάρης, Παναγιώτης; Perdikaris, Panagiotis
    Τα ελλείμματα στην κοινωνική επικοινωνία αποτελούν τον πυρήνα των κλινικών συμπτωμάτων πολλών νευροψυχιατρικών διαταραχών όπως η σχιζοφρένεια, οι διαταραχές του φάσματος του αυτισμού και η κατάθλιψη. Επίσης, τα αυξημένα επίπεδα άγχους αποτελούν μία κοινή συννοσηρότητα σε πολλές διαταραχές, ελαττώνοντας την ποιότητα της ζωής των ατόμων αυτών. Η έντονη συνέκφραση κοινωνικών ελλειμάτων και άγχους υποδηλώνει ότι οι δύο αυτές παθολογίες μοιράζονται κοινούς νευροβιολογικούς μηχανισμούς και εγκεφαλικά νευρικά δίκτυα, τα οποία όμως παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφή. Η ανισορροπία μεταξύ Διέγερσης/Αναστολής, σε διάφορες φλοιϊκές και υπο-φλοιϊκές περιοχές του Δικτύου Λήψης Κοινωνικών Αποφάσεων (Social Decision-Making Network, SDMN) καθώς και τα αυξημένα επίπεδα νευροφλεγμονής έχουν προταθεί ως κοινοί αιτιολογικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην εκδήλωση και των δύο παθολογιών. Επίσης, η συμβολή άλλων συστημάτων νευροδιαβίβασης, όπως του νοραδρενεργικού και του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος, καθώς και ο ρόλος της ενήλικης νευρογένεσης παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφή. Παλαιότερες μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν καταδείξει τα υψηλά επίπεδα έκφρασης αδρενεργικών υποδοχέων καθώς και την ύπαρξη σημαντικού ρυθμού νευρογένεσης, εντός του SDMN ζεβροϊχθύων, προτείνοντας την πιθανή συμβολή τους στη συν-εκδήλωση των δύο αυτών παθολογιών. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υποστηρίζουν ότι η ανισορροπία μεταξύ γλουταμινεργικής και GABAεργικής νευροδιαβίβασης καθώς και η δυσλειτουργία της ενδοκανναβινοειδούς σηματοδότησης που παρατηρείται στον εγκέφαλο ζεβροϊχθύων, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από υπολειτουργία των NMDA υποδοχέων, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο κατά την εκδήλωση των κοινωνικών ελλειμάτων και των αυξημένων επιπέδων άγχους. Επίσης, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης της προ-φλεγμονώδους κυτοκίνης IL-1β, σε νευρικά η αστρογλοιακά κύτταρα εντός συγκεκριμένων κόμβων του SDMN, αναδεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο των νευρο-φλεγμονωδών αποκρίσεων κατά την συν-εκδήλωση των παραπάνω διαταραχών. Πιο συγκεκριμένα, βάσει των αποτελεσμάτων μας προτείνουμε ότι μεταβολές στην γλουταμινεργική νευροδιαβίβαση εμπλέκονται στην εκδήλωση των κοινωνικών ελλειμάτων ενώ η GABAεργική και ενδοκανναβινοειδής δυσλειτουργία συσχετίζεται θετικά με την αγχώδη συμπεριφορά. Αντιθέτως, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης της IL-1β συνδέονται και με τις δύο συμπεριφορικές καταστάσεις. Όσο αφορά την κατεχολαμινεργική νευροδιαβίβαση, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την ύπαρξη αυξημένων επιπέδων έκφρασης του μεταφορέα της ντοπαμίνης και των β2-αδρενενεργικών υποδοχέων (β2-ARs) στον τελεγκέφαλο ζεβροϊχθύων που χαρακτηρίζονται από συμπεριφορά κοινωνικής αποφυγής και αυξημένα επίπεδα άγχους. Μάλιστα, είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση των β2-ARs ρυθμίζεται διαφορετικά εντός διαφορετικών περιοχών του SDMN, παρουσιάζοντας αυξημένα επίπεδα στον κοιλιακό πυρήνα του κοιλιακού τελεγκεφάλου (Vv) και μειωμένη έκφραση στον έσω πυρήνα του ραχιαίου τελεγκεφάλου (Dm) καθώς και στον πρόσθιο φυματικό πυρήνα (ATN). Επιπλέον, ο εντοπισμός των β2-ARs σε GABAεργικά και/ή mGluR5+ κύτταρα, υποστηρίζει τον πιθανό ρυθμιστικό ρόλο των β2-ARs κατά την συνέκφραση των ελλειμάτων στην κοινωνική συμπεριφορά και των αυξημένων επιπέδων άγχους, ρυθμίζοντας την ισορροπία μεταξύ διέγερσης/αναστολής. Tέλος, προτείνουμε ότι μεταβολές της δομικής πλαστικότητας και ειδικότερα της ενήλικης νευρογένεσης, σε περιοχές του ραχιαίου και κοιλιακού τελεγκεφάλου, όπως προκύπτει από τις μεταβολές του προτύπου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επιβίωσης των νευρικών βλαστικών κυττάρων, χαρακτηρίζει την συμπεριφορά κοινωνικής αποφυγής και τα αυξημένα επίπεδα άγχους των ζεβροϊχθύων. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής προτείνουν ότι η υπολειτουργία των NMDA υποδοχέων και η επακόλουθη πρόκληση ανισορροπίας μεταξύ Διέγερσης/Αναστολής, εντός περιοχών του SDMN, σχετίζεται με τα σοβαρά ελλείμματα στην κοινωνική συμπεριφορά και τα αυξημένα επίπεδα άγχους που εμφανίζουν οι ζεβροϊχθύες. Επιπρόσθετα, οι μεταβολές στην κατεχολαμινεργική και ενδοκανναβινοειδή σηματοδότηση, τα αυξημένα επίπεδα νευροφλεγμονής και οι μεταβολές του προτύπου της ενήλικης νευρογένεσης, πιθανόν συνεισφέρουν στη συννοσηρότητα των παραπάνω παθολογιών. Τα αποτελέσματά μας επομένως αναδεικνύουν την ύπαρξη επιπρόσθετων νευροβιολογικών μηχανισμών και περιοχών που εμπλέκονται στην εκδήλωση των κοινωνικών ελλειμμάτων και των αυξημένων επιπέδων άγχους, έπειτα από υπολειτουργία των NMDA υποδοχέων, παρέχοντας νέους πιθανούς στόχους για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών και στοχευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων με στόχο την υποχώρηση των παραπάνω συμπτωμάτων.
  • ItemOpen Access
    Γενικευμένη επιγενετική (μεθυλίωση CpG) και τρανσκριπτομική ανάλυση στις βιολογικές επιπτώσεις των βιοανθεκτικών οργανικών ρύπων (POPs) σε ανθρώπινα λευκά κύτταρα αίματος
    (2023-01-12) Βιδάλη, Μαρία Σοφία; Vidali, Maria Sofia
    Στην παρούσα εργασία γίνεται εκτενής μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων αντιπροσωπευτικών χημικών ουσιών/ενώσεων μιας ευρείας ομάδας περιβαλλοντικών ρύπων που είναι γνωστοί ως επίμονοι οργανικοί ρύποι ή αλλιώς POPs (Persistent Organic Pollutants). Οι POPs είναι χημικές ουσίες παγκόσμιας ανησυχίας λόγω των σημαντικών συγκεντρώσεών τους στα υδάτινα οικοσυστήματα, της ικανότητάς τους να μεταφέρονται σε μεγάλες αποστάσεις, καθώς και των σημαντικών επιπτώσεών τους στην ανθρώπινη υγεία και στο περιβάλλον. Η κύρια οδός έκθεσης σε POPs είναι μέσω της από του στόματος κατανάλωσης τροφίμων που ακολουθείται από βιοσυσσώρευση σε βιολογικές μήτρες, όπως ο λιπώδης ιστό και το πλάσμα του αίματος. Η ικανότητά τους να συσσωρεύονται μέσω της τροφικής αλυσίδας, τα καθιστά δυνητικό κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον. Μεταξύ των POPs, τα πολυχλωριωμένα διφαινύλια (PCBs) είναι υψίστης σημασίας, μιας και χρησιμοποιήθηκαν σε εκατοντάδες βιομηχανικές και εμπορικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων ηλεκτρικών και υδραυλικών εφαρμογών, εφαρμογών μεταφοράς θερμότητας, ως πλαστικοποιητές σε χρώματα, πλαστικά, και σε πολλές άλλες. Η ευρεία χρήση των PCBs, σε συνδυασμό με ακατάλληλες πρακτικές απόρριψης, έχει οδηγήσει σε σημαντική επιβάρυνση του περιβάλλοντος από εμπορικά σκευάσματα. Το 2016, ο Διεθνής Οργανισμός Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC) αναβάθμισε τα PCBs από την προηγούμενη Ομάδα 2Α «Πιθανώς καρκινογόνο για τον άνθρωπο» στην Ομάδα 1 «Καρκινογόνα για τον άνθρωπο» βασιζόμενοι κυρίως σε επαρκή στοιχεία για αυξημένο κίνδυνο δερματικού κακοήθους μελανώματος. Επίσης, τα PCBs έχουν συνδεθεί με ανοσοκαταστολή, βλάβη των μακροφάγων και καρκίνο, συμπεριλαμβανομένου του λεμφώματος μη Hodgkin (NHL). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι τα PCBs έχουν ανοσοτοξικές, προφλεγμονώδεις, ενδοκρινικές και αναπαραγωγικές επιπτώσεις, ενώ ευθύνονται και για νευροαναπτυξιακές ανωμαλίες, αλλαγές συμπεριφοράς και ανεπάρκειες στην ανάπτυξη των παιδιών. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της έκθεσης σε PCBs και των αλλαγών στη μεθυλίωση του DNA σε όλο το γονιδίωμα λευκοκυττάρων υγιών εθελοντών, παρέχοντας στοιχεία που υποστηρίζουν μια αιτιολογική σχέση μεταξύ των παρατηρούμενων αλλαγών της μεθυλίωσης CpG και της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας. Με βάση τα παραπάνω, η παρούσα μελέτη έχει στόχο να αποσαφηνίσει τις επιδράσεις των PCBs στη μεθυλίωση των ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro. Ως εκ τούτου, η κυτταρική σειρά U937 και μονοκύτταρα ανθρώπινου περιφερικού αίματος (PBMCs) εκτέθηκαν σε PCB-118 (ενός PCB με μορφή διοξίνης), στο PCB-153 (ενός PCB που δεν έχει τη μορφή διοξίνης) και στο εξαχλωροβενζόλιο (HCB) και έγιναν λεπτομερείς αναλύσεις κυτταροτοξικότητας, γονοτοξικότητας και CpG μεθυλίωσης. Όλες οι ενώσεις που ελέγχθηκαν δεν έδειξαν κάποια σημαντική γονοτοξικότητα σε όλες τις περιόδους έκθεσης και τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Αντίθετα, εκτεταμένη δοσοεξαρτώμενη υπομεθυλίωση παρατηρήθηκε, ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις, σε διεγερμένα PBMCs στα οποία χορηγήθηκε PCB 118 και PCB 153, καθώς και μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική υπομεθυλίωση σε διεγερμένα κύτταρα με χορήγηση HCB. Στη συνέχεια, ακολούθησε ολιστική τοξικογενομική μελέτη σε ενεργοποιημένα και μη-ενεργοποιημένα PBMCs με χρήση της μικροσυστοιχίας InfiniumMethylEpic για να διαπιστωθούν αλλαγές στη CpG μεθυλίωση και αλληλούχηση Νέας Γενιάς για την μεταγραφομική ανάλυση. Στα ενεργοποιημένα και μη-ενεργοποιημένα PBMCs η διαφοροποίηση από τα δείγματα αναφοράς ακολουθεί την σειρά PCB 153>PCB 118>HCB και PCB 118>PCB 153>HCB, αντίστοιχα, ενώ βρέθηκαν πολλές κοινές διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις τόσο μεταξύ των δυο PCBs όσο και μεταξύ PCBs και HCB στα ενεργοποιημένα και στα μη-ενεργοποιημένα PBMCs. Οι πολύ χαμηλές τιμές σημαντικότητας μετά από υπεργεωμετρική ανάλυση υποδήλωσαν ότι οι μηχανισμοί που επιδρούν τα επιλεγμένα POPs στην CpG μεθυλίωση έχουν σημαντικές ομοιότητες. Μετά από βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων που αντιστοιχούν σε επιλεγμένες διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις με ασθένειες τόσο για τα ενεργοποιημένα όσο και για τα μη-ενεργοποιημένα PBMCs βρέθηκαν συσχετίσεις με διάφορα είδη καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων της λευχαιμίας και την λεμφοειδούς λευχαιμίας, καθώς και πληθώρα ψυχικών και νευρογνωστικών διαταραχών. Στην ανάλυση των διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών βρέθηκε σαφής εμπλουτισμός ομοιοακόλουθων γονιδίων και στην βιοπληροφορική ανάλυση συσχετισμός με μεγάλο αριθμός καρκίνων του αίματος τόσο στα ενεργοποιημένα όσο και στα μη-ενεργοποιημένα PBMCs. Η μεταγραφομική ανάλυση έδειξε ότι αρχικά τα μη-ενεργοποιημένα PBMCs στον χρόνο μελέτης δεν έχουν δώσει αρκετές πληροφορίες προς ανάλυση και στα ενεργοποιημένα PBMCs μεγάλο ποσοστό των RNAs που αναλύθηκαν ανήκουν στην κατηγορία των lncRNA. Η μεταγραφομική βιοπληροφορική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στα βιολογικά μονοπάτια, έδειξε ότι τόσο το PCB 118 όσο και το PCB 153 επηρεάζουν βασικές αλληλεπιδράσεις της λειτουργίας των κυττάρων.
  • ItemOpen Access
    Ο ρόλος του ορφανού πυρηνικού υποδοχέα NR5A2 στις νεοπλασίες του νευρικού συστήματος
    Γκίκας, Δημήτριος; Gkikas, Dimitrios
    Οι κακοήθειες του νευρικού συστήματος χαρακτηρίζονται από ταχεία εξέλιξη και χαμηλά ποσοστά επιβίωσης. Αυτές οι κλινικές παρατηρήσεις υπογραμμίζουν την ανάγκη για εξέρευση νέων φαρμακολογικών στόχων και θεραπευτικών προσεγγίσεων. Προς αυτό το στόχο και στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας προσδιορίσαμε τον ορφανό πυρηνικό υποδοχέα NR5A2/LRH1 ως αρνητικό ρυθμιστή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και ως ένα πολλά υποσχόμενο φαρμακολογικό στόχο για τους όγκους που σχετίζονται με το νευρικό σύστημα. Ειδικότερα, βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από όγκους ασθενών διαθέσιμων σε βάσεις δεδομένων, όπως οι Oncomine και TCGA (The Cancer Genome Atlas), δείχνουν ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του NR5A2 σχετίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση σε ασθενείς με όγκους γλοιοβλαστώματος και νευροβλαστώματος. Στη συνέχεια, με μία σειρα πειραμάτων υπερέκφρασης δείξαμε ότι το NR5A2 είναι επαρκές για να καταστείλει έντονα τον πολλαπλασιασμό τόσο των ανθρώπινων όσο και των ποντικίσιων κυττάρων γλοιοβλαστώματος και νευροβλαστώματος χωρίς να επάγει την απόπτωση τους. Επιπλέον, η καταστολή της έκφρασης του NR5A2, με τη χρήση ειδικών shRNA φορέων, προάγει τον πολλαπλασιασμό και τον κυτταρικό κύκλο των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Επίσης, η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του NR5A2 διαμεσολαβείται από τη μεταγραφική επαγωγή των αρνητικών ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, CDKN1A (που κωδικοποιεί την p21cip1), CDKN1B (που κωδικοποιεί την p27kip1) και Prox1. Στο πλαίσιο της φαρμακολογικής στόχευσης αυτού του μορίου δείξαμε ότι δύο καθιερωμένοι αγωνιστές του NR5A2, η διλουροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DLPC) και η διουνδεκανοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DUPC), είναι σε θέση να μιμηθούν την αντι-πολλαπλασιαστική δράση του NR5A2 σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος μέσω της επαγωγής των ίδιων κρίσιμων γονιδίων. Η πιο σημαντική μας παρατήρηση όμως είναι ότι ένας από αυτούς τους αγωνιστές, ο DLPC, είναι αφενός ικανός να περάσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και αφετέρου να καταστείλει την ανάπτυξη των όγκων του γλοιοβλαστώματος in vivo σε ετεροτοπικά και ορθοτοπικά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικών. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν έναν ογκοκατασταλτικό ρόλο του NR5A2 στο νευρικό σύστημα και καθιστούν αυτόν τον πυρηνικό υποδοχέα δυνητικό φαρμακολογικό στόχο για τη θεραπεία όγκων που σχετίζονται με τον νευρικό ιστό.
  • ItemOpen Access
    Μελέτη της αύξησης μικροφυκών σε ανακυκλώσιμα νερά ιχθυοτροφείων και παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας
    Ντούρου, Μαριάννα; Dourou, Marianna
    H βιομάζα των μικροφυκών είναι πλούσια σε βιοδραστικές ενώσεις υψηλού βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος, με πολλαπλές εμπορικές εφαρμογές κι έτσι τα τελευταία χρόνια η καλλιέργειά τους σε μεγάλη κλίμακα έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον ερευνητών και παραγωγικών μονάδων. Ωστόσο, η βιωσιμότητα της διαδικασίας επηρεάζεται αρνητικά από το υψηλό κόστος του μέσου καλλιέργειας και από τους τεράστιους όγκους νερού οι οποίοι απαιτούνται για την καλλιέργεια μικροφυκών. Από την άλλη, ο κλάδος της υδατοκαλλιέργειας, ολοένα και αυξανόμενος, συνδέεται με επιβλαβείς επιπτώσεις στους υδροφόρους ορίζοντες, εξαιτίας των υγρών αποβλήτων τα οποία παράγει. Αποτελεσματική εναλλακτική προσέγγιση για την αύξηση της βιωσιμότητας της διαδικασίας αποτελεί η αξιοποίηση των υγρών αποβλήτων υδατοκαλλιέργειας ως μέσο ανάπτυξης μικροφυκών. Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, παραλήφθηκαν τρία υγρά απόβλητα από δεξαμενές εκτροφής ιχθύων διαφορετικού σωματικού βάρους από Ελληνική μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας και ένα ακόμη από την κεντρική δεξαμενή καθίζησης της ιδίας εταιρίας. Σύμφωνα με τα προκαταρκτικά πειράματα, το απόβλητο προερχόμενο από τη δεξαμενή καθίζησης (effluent from the sedimentation tank, EST) αποδείχθηκε το καταλληλότερο να υποστηρίξει την αύξηση του μικροφύκους Nannochloropsis gaditana, σε καλλιέργειές του σε κωνικές φιάλες. Η χημική του σύσταση εμφάνισε εξάρτηση από το μέγεθος των εκτρεφόμενων ιχθύων. Πιο συγκεκριμένα, μήνες κατά τους οποίους στη μονάδα εκτρέφονταν ιχθύες μικρού σωματικού βάρους, στη δεξαμενή καθίζησης κατέληγαν λύματα πλούσια σε φώσφορο (P), έτσι ο ο λόγος Ν/P του αποβλήτου σε μία περίοδο παραλαβής ήταν 20,9 (μοναδική τιμή). Αντίθετα, όταν εκτρέφονταν ιχθύες μεγάλου σωματικού βάρους, στη δεξαμενή καθίζησης κατέληγαν λύματα στα οποία ο P βρισκόταν σε πενία, ενώ οι αζωτούχες ενώσεις σε περίσσεια. Συγκεκριμένα, σε δύο περιόδους παραβής, ο λόγος N/P ισούνταν με 1333,4 και 298,4 (μοναδικές τιμές). Βάσει των ανωτέρω, τα απόβλητα της ιχθυοκαλλιέργειας χαρακτηρίστηκαν στην παρούσα διατριβή ως πλούσια (EST_P+) και περιοριστικά (EST_P-) σε φώσφορο. Σύμφωνα με προκαταρκτικά πειράματα καλλιέργειας μικροφυκών σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer υπό συνεχή φωτισμό και περιοδική ανάδευση, η ανάπτυξη των στελεχών N. oculata και Nannochloropsis sp. παρεμποδίστηκε από τη χημική σύσταση του EST_P+, ενώ τα είδη N. atomus, N. gaditana, Tetraselmis suecica και Tisochrysis lutea αναπτύχθηκαν ικανοποιητικά σε αυτό. Τα ικανά να αναπτυχθούν στο EST_P+ στελέχη μικροφυκών καλλιεργήθηκαν σε δύο τύπους εργαστηριακού φωτο-βιοαντιδραστήρα υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι, προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση διαφόρων παραμέτρων στην αύξηση και τη φυσιολογία τους. Στον προσομοιάζοντα με ανοικτή δεξαμενή φωτο-βιοαντιδραστήρα (open pond simulationg reactor, OPSR) η ροή παροχής αέρα ήταν 150 L/h, η ένταση φωτισμού 245 μmol m-2 s-1 και η ανάδευση πραγματοποιούνταν μέσω μικρής αντλίας με ροή 150 L/h. Από την άλλη, στον φωτο-βιοαντιδραστήρα κλειστού τύπου (stirred tank reactor, STR) η ροή παροχής αέρα ήταν χαμηλότερη (= 37,5 L/h), η ένταση του φωτός ισχυρότερη (= 1636 μmol m-2 s-1) και η ανάδευση πιο ομοιόμορφη, κάτι το οποίο εξασφαλιζόταν από τα δύο στροφεία ανάδευσης έξι περιστρεφόμενων πτερυγίων, τα οποία διαθέτει ο βιοαντιδραστήρας. Επίσης πραγματοποιήθηκαν και καλλιέργειες-ελέγχου των ανωτέρω στελεχών μικροφυκών στον φωτο-βιοαντιδραστήρα OPSR σε μέσο καλλιέργειας τεχνητό θαλασσινό νερό (artificial seawater, ASW) περιοριστικό σε φώσφορο (ASW_P-), το οποίο έχει χαμηλότερη αλατότητα (= 27,0 g/L) από το υγρό απόβλητο. Η μέγιστη παραγωγή ξηρής βιομάζας (dry cell mass, x) από το είδος N. gaditana (x = 847,0 mg/L με παραγωγικότητα Px = 180 mg/L*d) παρατηρήθηκε όταν καλλιεργήθηκε σε μέσο καλλιέργειας EST_P+ στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR. Αντίθετα, η μέγιστη συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας (lipids in the dry cell mass, L/x), δηλαδή L/x = 24,7%, παρατηρήθηκε όταν το στέλεχος καλλιεργήθηκε σε μέσο ανάπτυξης EST_P-. Έτσι, και τα υπόλοιπα υπό μελέτη στελέχη μικροφυκών καλλιεργήθηκαν σε περιοριστικό σε P απόβλητο. Η πενία P σε συνδυασμό με την υψηλή αλατότητα του EST_P- επηρέασε αρνητικά την παραγωγή ξηρής βιομάζας συγκριτικά με τις καλλιέργειές τους στο ASW_P-, στον φωτο-βιοαντιδραστήρα OPSR. Πιο συγκεκριμένα, το N. atomus παρήγαγε x = 84,0 mg/L (έναντι 156,3 mg/L στο ASW_P-), το T. suecica x = 263,3 mg/L (έναντι 724,0 mg/L στο ASW_P-) και το T. lutea x = 128,1 mg/L (έναντι 193,1 mg/L στο ASW_P-). Η παραγόμενη βιομάζα ωστόσο, ήταν περισσότερο πλούσια σε αποθεματικά μόρια. Συγκεκριμένα, ευνοήθηκε σημαντικά η συσσώρευση λιπιδίων και πολυσακχαριτών (polysaccharides in the dry cell mass, S/x) στο είδος N. atomus, αφού L/x = 36,2 και S/x = 33,8% (έναντι 11,7 και 8,7%, αντίστοιχα στο ASW_P-). Παρόμοια, το T. lutea συσσώρευσε L/x = 36,5 και S/x = 26,8% καλλιεργούμενο στο EST_P- (έναντι 16,4 και 9,6%, αντίστοιχα στο ASW_P-). Στο είδος T. suecica επηρεάστηκε σημαντικά μόνο η συσσώρευση πολυσακχαριτών (S/x = 42,9% στο EST_P-). Το περιεχόμενο σε πρωτεΐνες (proteins in the dry cell mass, P/x) δεν επηρεάστηκε από το μέσο καλλιέργειας και παρέμεινε σε υψηλά ποσοστά σε κάθε περίπτωση. Το απόβλητο EST_P- επηρέασε τη σύσταση των ολικών λιπιδίων (total lipids - TL) σε λιπιδιακά κλάσματα, κι έτσι στα TL των N. gaditana, N. atomus και T. suecica υπερέχον λιπιδιακό κλάσμα ήταν αυτό των ουδέτερων λιπιδίων (neutral lipids, NL). Αντίθετα, κατά την καλλιέργειά τους στο ASW_P- υπερέχον λιπιδιακό κλάσμα ήταν αυτό των γλυκο- και σφιγγολιπιδίων (glycolipids + sphingolipids, G+S). Τέτοια επίδραση δεν παρατηρήθηκε στα TL του T. lutea. Επιπροσθέτως, το αποβλήτο επηρέασε το προφίλ σε λιπαρά οξέα των TL και την κατανομή των λιπαρών οξέων στα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα, αφού αναστάλθηκε η βιοσύνθεση των n-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) και ο δείκτης ακορεστότητας (unsaturated index, U.I.), όπως και ο λόγος n-3/n-6 εμφάνισαν μειωμένες τιμές στα TL και τα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα των ειδών N. gaditana, N. atomus και T. suecica. Εξαίρεση αποτέλεσε το στέλεχος T. lutea, στο οποίο τα ΣPUFAs και Σn-3 αυξήθηκαν στα πολικά κλάσματα κατά την καλλιέργειά του στο απόβλητο. Παρά την υψηλή ένταση φωτισμού, η οποία επικρατούσε στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR, δεν παρατηρήθηκαν φαινόμενα αναστολής της αύξησης για κανένα από τα υπό εξέταση μικροφύκη. Αντίθετα, οι συνθήκες οι οποίες επικρατούσαν στον STR ευνόησαν την παραγωγή ξηρής βιομάζας συγκριτικά με τις συνθήκες στον OPSR, ενώ η συσσώρευση αποθεματικών μορίων παρέμεινε σε υψηλά ποσοστά και αυτό ισχύει για όλα τα μικροφύκη, καλλιεργούμενα στο EST_P-. Ωστόσο, το σύστημα καλλιέργειας επηρέασε τη σύσταση των λιπιδίων και λιπιδιακών κλασμάτων σε λιπαρά οξέα. Οι συνθήκες ανάπτυξης στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR ευνόησαν τη βιοσύνθεση του C14:0 από το N. gaditana και του C18:3 n-3 από το N. atomus, ενώ παρατηρήθηκε αναστολή της βιοσύνθεσης του C18:1 n-7 από το T. suecica και του C14:1 n-5 από το T. lutea. Μελετήθηκε επίσης η επίδραση της φωτοπεριόδου στην παραγωγή βιομάζας και μεταβολικών προϊόντων από το μικροφύκος N. gaditana καλλιεργούμενο σε μέσο ανάπτυξης EST_P-. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, υπό φωτοπερίοδο 12 h φως : 12 h σκοτάδι δεν ευνοήθηκε η αύξηση του μικροφύκους (x = 62,8 mg/L). Όμως, η συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας ευνοήθηκε υπό φωτοπερίοδο 16 h φως : 8 h σκοτάδι (L/x = 30,6%) συγκριτικά με την καλλιέργεια του μικροφύκους υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Στο μικροφύκος N. gaditana, εξετάστηκε επίσης και η επίδραση του αρχικού εμβολίου και αποδείχθηκε ότι, ανεξαρτήτως της φωτοπεριόδου, καλλιέργεια η οποία εμβολιάστηκε με μικρό μέγεθος εμβολίου οδήγησε σε χαμηλότερης πυκνότητας καλλιέργεια, χαμηλότερη συγκέντρωση παραγόμενης βιομάζας, πλουσιότερης ωστόσο σε αποθεματικά μόρια (λιπίδια και πολυσακχαρίτες). Επιπλέον, το μικροφύκος N. gaditana καλλιεργήθηκε σε πιλοτική κλίμακα σε θερμοκρασία χαμηλότερη από αυτήν που επικρατούσε στις μελέτες στο εργαστήριο (T = 20 °C), σε μέσο ανάπτυξης EST_P-, υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Η παραγόμενη βιομάζα κρίθηκε ικανοποιητική (x = 403,7 mg/L), όμως το μικροφύκος συσσώρευσε σε χαμηλά ποσοστά αποθεματικά συστατικά (L/x = 10,1 και S/x = 6,4%). Ωστόσο, η χαμηλή θερμοκρασία ευνόησε τη βιοσύνθεση του λιπαρού οξέος C20:5 n-3 τόσο στα TL, όσο και στα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν επίσης η μελέτη της ικανότητας αυτότροφου μικροοργανισμού να δεσμεύσει και να αξιοποιήσει το παραγόμενο από καλλιέργεια ετερότροφου μικροοργανισμού CO2. Στέλεχος της ελαιογόνου ζύμης Yarrowia lipolytica καλλιεργήθηκε στον βιοαντιδραστήρα STR και τα παραγόμενα από το μεταβολισμό αέρια της ζύμης χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή άνθρακα σε καλλιέργειες του μικροφύκους N. gaditana και συγκρίθηκαν με καλλιέργειες-ελέγχου του μικροφύκους, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν με παροχή φυσικού αέρα. Η ζύμη Y. lipolytica καλλιεργούμενη σε σύστημα ημι-συνεχούς λειτουργίας, παρήγαγε 14,7 g/L βιομάζα, 6,1 g/L κιτρικό οξύ, συσσώρευσε L/x = 18,2%, S/x = 35,1%, P/x = 18,8%, και κατά μέσο όρο απελευθέρωνε 5,3 g/L*d CO2, το οποίο από τον 4ο κύκλο αύξησής της διοχευόταν σε δύο ανεξάρτητες μεταξύ τους καλλιέργειες του N. gaditana με ρυθμό παροχής αέρα 45 L/h. Το μικροφύκος καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer σε μέσο ανάπτυξης ASW_P- υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Κατά τις καλλιέργειες-ελέγχου, το πρότυπο της αύξησης του μικροφύκους ήταν γραμμικό, αντίθετα, όταν η καλλιέργεια εμπλουτίστηκε με τα αέρια της ζύμης, το πρότυπο της αύξησης άλλαξε στο τυπικό σιγμοειδές πρότυπο αύξησης υπό τον έλεγχο ενός μόνον περιοριστικού για την αύξηση παράγοντα. Ο ρυθμός δέσμευσης του CO2 (bio-sequestration rate, RCO2) δε διέφερε μεταξύ των συνθηκών αερισμού και η παραγωγικότητα του μικροφύκους, όσον αφορά στην παραγωγή βιομάζας και τη συσσώρευση αποθεματικών μορίων, ήταν χαμηλότερη όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε με παροχή μίγματος αερίων της ζύμης, ενώ η παραγωγή πρωτεϊνών ήταν υψηλότερη. Έπειτα από μικροσκοπική παρατήρηση φάνηκε ότι o εμπλουτισμός με τα αέρια της ζύμης οδήγησε σε μεγαλύτερα σε μέγεθος κύτταρα του μικροφύκους, συγκριτικά με τις καλλιέργειες-ελέγχου. Παρατηρήθηκε επίσης επίδραση στη σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα, καθώς τα TL και τα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα του N. gaditana ήταν περισσότερο πολυακόρεστα, όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε με CO2 προερχόμενο από το μεταβολισμό της ζύμης. Συγκεκριμένα η αύξηση της ακορεστότητας αφορούσε περισσότερο σε αύξηση του λιπαρού οξέος C20:5 n-3. Επιπλέον, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης, αποδεικνύεται ότι η βιοσύνθεση των PUFAs σχετίζεται με την αύξηση των φωτοσυνθετικών μεμβρανών και όχι με τη συσσώρευση ουδέτερων λιπιδίων, αφού C20:5 n-3(G) ήταν >20 mg/gxf , ενώ C20:5 n-3(NL) ήταν <5 mg/gxf και στις δύο συνθήκες αερισμού του N. gaditana. Επιπροσθέτως, μεταξύ των συνθηκών αερισμού δεν επηρεάστηκε σημαντικά η σχετική ενεργότητα της ελονγκάσης στο N. gaditana, αντίθετα της Δ9 αποκορεσμάσης αυξήθηκε σημαντικά στο κλάσμα των NL, ενώ της Δ12 αποκορεσμάσης μειώθηκε στο ίδιο κλάσμα. Και οι δύο αποκορεσμάσες εμφάνισαν υψηλή ενεργότητα στο κλάσμα των G, όταν η καλλιέργεια του μικροφύκους εμπλουτίστηκε με CO2 προερχόμενο από την καλλιέργεια της ζύμης. Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, το είδος N. gaditana επιλέχθηκε για την ανάπτυξη στρατηγικής εργαστηριακής προσαρμοστικής εξέλιξης (adaptive laboratory evolution, ALE). Υποβλήθηκε σε 15 διαδοχικούς αυξητικούς κύκλους, οι οποίοι περιλάμβαναν την ανάπτυξή του σε συνθήκες ευνοϊκές για συσσώρευση αποθεματικών ουσιών (καλλιέργεια για 240 h σε φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι σε θρεπτικό μέσο ASW_P-), ακολουθούμενες από συνθήκες οι οποίες ευνοούν την αποδόμηση των αποθεματικών υλικών (καλλιέργεια για 240 ή 340 h σε συνθήκες σκότους ή/και απουσία CO2). Τελικά, ο εξελιγμένος/προσαρμοσμένος πληθυσμός μετά από 28,8 γενεές, παρουσίασε κατά 19,6% χαμηλότερο ρυθμό δέσμευσης του CO2 (RCO2 = 24,2 mg/L*d) συγκριτικά με το άγριο στέλεχος, με αποτέλεσμα να παρουσιαστεί μειωμένη κατά 34,4% παραγωγικότητα Px, μειωμένη κατά 8,3% συσσώρευση λιπιδίων, αυξημένη κατά 19,6% παραγωγή πρωτεϊνών, ενώ δεν εμφανίστηκε διαφορά στη συσσώρευση πολυσακχαριτών. Επιπλέον, το κλάσμα των NL μειώθηκε κατά 32,1%, ενώ το κλάσμα των PL αυξήθηκε κατά 160%. Σύμφωνα με τις φωτογραφίες των κυττάρων σε συνεστιακό μικροσκόπιο, παρατηρήθηκε ότι το μέγεθος των χλωροπλαστών μεγάλωσε κατά τις συνθήκες σκότους στους πρώτους αυξητικούς κύκλους, και με την πάροδο των γενεών το μεγάλο μέγεθος διατηρήθηκε και κατά τις συνθήκες φωτός. Επιπλέον, οι χρωστικές «μετακινήθηκαν» προς τις φωτοσυνθετικές μεμβράνες των εξελιγμένων στελεχών του N. gaditana και εκχυλίστηκαν στα πολικά κλάσματα, κυρίως στο κλάσμα των G, και όχι στο κλάσμα των NL, όπως συνέβη για το άγριο στέλεχος. Το προφίλ των TL σε λιπαρά οξέα δεν άλλαξε σε σημαντικό βαθμό. Ωστόσο, ως απόκριση στην εξελικτική πίεση στην οποία υποβλήθηκε το μικροφύκος N. gaditana, το κλάσμα των NL έγινε περισσότερο πλούσιο σε κορεσμένα λιπαρά οξέα (saturated fatty acids, SFAs) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (monosaturated fatty acids, MUFAs), ενώ τα πολικά κλάσματα G και PL έγιναν περισσότερο πλούσια σε ΣPUFAs, με αποτέλεσμα ο δείκτης U.I. να αυξηθεί κατά 35,7 και 83,3% στο κλάσμα των G και PL, αντίστοιχα. Η αύξηση αυτή αφορούσε κυρίως σε αύξηση του C20:5 n-3(PL) από 1,1 mg (άγριο στέλεχος) σε 4,3 mg (εξελιγμένο στέλεχος). Στο τελευταίο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής εξετάστηκε η δυνατότητα ενσωμάτωσης βιομάζας μικρο- και μακροφυκών στο σιτηρέσιο του Ευρωπαϊκού λαβρακιού (Dicentrarchus labrax). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ενσωμάτωση ξηρής βιομάζας του μικροφύκους Nannochloropsis sp. οδήγησε σε αύξηση των n-3 λιπαρών οξέων στην νέα ιχθυοτροφή και ο λόγος n-3/n-6 αυξήθηκε κατά 75% συγκριτικά με την εμπορική ιχθυοτροφή. Η αύξηση αυτή επηρέασε τη σύσταση της σάρκας των ιχθύων, αυξάνοντας το Σn-3 κατά 17,4% και τον λόγο n-3/n-6 κατά 43,8%.
  • ItemOpen Access
    Μεταβολικές διαταραχές και συστημική βιολογία : εφαρμογή στην αναζήτηση μεταβολικών βιοδεικτών ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή και στη συνδυαστική μεταβολική μελέτη οργάνων ενήλικων υποθυρεοειδικών μυών με μεταβολομική
    (2022-09-09) Ιωαννίδη, Μαρία Κωνσταντίνα; Ioannidi, Maria Konstantina
    Οι μεταβολικές διαταραχές συνδέονται με πλήθος νοσημάτων στον άνθρωπο, που τις καθιστούν από τα σοβαρότερα προβλήματα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται μία ραγδαία αύξηση στο ποσοστό του πληθυσμού που εμφανίζει κακό καρδιομεταβολικό πρότυπο στην ενήλικη ζωή και επηρεάζεται από κάποιου είδους μεταβολική διαταραχή, καθιστώντας αναγκαία την περαιτέρω διερεύνησή των μεταβολικών διαταραχών ως προς τις αιτίες και τους τρόπους αντιμετώπισής τους. Στη σύγχρονη βιολογία και ιατρική, η ολιστική ανάλυση της μοριακής φυσιολογίας πολλών ιστών, είτε μεμονωμένα αλλά και συνδυαστικά, με τη χρήση βιομοριακών αναλύσεων υψηλής απόδοσης (ή αλλιώς ομικών αναλύσεων) μπορεί να παρέχει μία λεπτομερή εικόνα ιστοειδικών χαρακτηριστικών, που συνδέονται με μια μεταβολική διαταραχή αλλά και συνολικών ρυθμιστικών μηχανισμών που εμπλέκουν περισσότερους ιστούς. Ιδιαίτερα, η ολιστική ανάλυση του μεταβολικού προτύπου (μεταβολομική) ιστών στο πλαίσιο αυτών των μεταβολικών παθοφυσιολογιών κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική, με σημαντική συμβολή στη συστημική φυσιολογία εάν αξιοποιηθεί κατάλληλα για μεταφραστικές εφαρμογές. Η μεταβολομική ανάλυση ιστών σε συνθήκες μεταβολικής διαταραχής είναι μια πολυβηματική διαδικασία, που απαιτεί προσεγμένο πειραματικό σχεδιασμό και εκτέλεση όλων των πειραματικών σταδίων, ώστε να αποδώσει αξιόπιστα δεδομένα που να μπορούν να αξιοποιηθούν για την εξαγωγή βιολογικών συμπερασμάτων. Σημειώνεται ότι ως προς τον πειραματικό σχεδιασμό, την επιλογή του κατάλληλου μοντέλου και του δείγματος της μελέτης, και των πειραματικών πρωτοκόλλων προαναλυτικών σταδίων, δηλ. συλλογής και χειρισμού δειγμάτων, και εάν χρειάζεται διαπότισης (perfusion) των ιστών, και των αναλυτικών σταδίων ποσοτικοποίησης του μεταβολικού προτύπου, η μεταβολομική βρίσκεται ακόμα σε στάδιο προτυποποίησης για ένα ευρύ σύνολο τύπων δείγματος, πειραματικών μοντέλων και εφαρμογών. Επίσης, στο υπολογιστικό τμήμα της μεταβολομικής ανάλυσης, η επεξεργασία, το φιλτράρισμα, η κανονικοποίηση και η ανάλυση των δεδομένων απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή και χειρισμό. Τέλος, η ανακατασκευή του μεταβολικού δικτύου που αντιστοιχεί στα μεταβολομικά δεδομένα αποτελεί πρόκληση, καθώς δεν υπάρχουν γενικώς αποδεκτά μεταβολικά μοντέλα για τους ιστούς θηλαστικών, ενώ υπάρχουν πλήθος ανοιχτά ερωτήματα ως προς τις αντιδράσεις που είναι ενεργές σε έναν ιστό και το εάν τα μόρια που προσδιορίζονται είναι ενδογενή ή προέρχονται από άλλους ιστούς στους οποίους παράγονται. H παρούσα διατριβή στόχευσε στην αριστοποιημένη εφαρμογή της μεταβολομικής ανάλυσης, με χρήση χρωματογραφίας αερίων-φασματομετρίας μάζας στο πλαίσιο δύο διακριτών μελετών μεταβολικών διαταραχών, η μια στο πλαίσιο της μεταφραστικής ιατρικής και η δεύτερη σε ζωϊκό μοντέλο. Στην πρώτη μελέτη, διερευνήθηκε η χρησιμότητα της μεταβολομικής ανάλυσης πλάσματος αίματος για τον προσδιορισμό μιας μεταβολικής υπογραφής, διακριτικής υγιών ατόμων ως προς την ιστοευαισθησία τους στα γλυκοκορτικοειδή, όταν δεν φέρουν μεταλλάξεις ή πολυμορφισμούς στο γονίδιο του ανθρώπινου υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (hGR), NR3C. Στην δεύτερη εφαρμογή, μελετήθηκε η επίδραση του χρόνιου υποθυρεοειδισμού ενηλίκων (ΧΥΕ) στον καρδιακό ιστό σε μοντέλο μυός χημικής επαγωγής της φυσιολογίας, και στα δύο φύλα και δύο στάδια χημικής επαγωγής της διαταραχής, διερευνώντας φυλοειδικές διαφορές εξέλιξης της νόσου και συγκρίνοντάς τις με αποτελέσματα μεταβολικής φαινοτύπησης εγκεφαλικών περιοχών των ίδιων ζώων. Η μελέτη ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή ήταν η πρώτη αυτού του είδους διεθνώς και κατέδειξε ότι υπάρχει διακριτό μεταβολικό πρότυπο λόγω ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή, που θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω σε συνδυασμό με άλλα ομικά πρότυπα, κυρίως το πρωτεϊνωματικό. Παρατηρήθηκε υψηλότερος ρυθμός του κύκλου Cori, του μονοπατιού των πολυολών και του μεταβολισμού ενός άνθρακα, και χαμηλότερος ρυθμός μεταφοράς λιπαρών οξέων (lipid acid mobilization) στην κατάσταση νηστείας, στην πιο ευαίσθητη σε σύγκριση με την πιο ανθεκτική ομάδα. Εντοπίσαμε μια μεταβολική υπογραφή 19 μεταβολιτών, που εμφανίζει σημαντική διαφορά στη συγκέντρωση μεταξύ των δύο ομάδων, υποστηρίζοντας τη συσχέτιση της ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή με την αντίσταση στην ινσουλίνη και τα μονοπάτια που σχετίζονται με το μεταβολικό σύνδρομο. Σε συνδυασμό με τα κλινικά συμπτώματα, θα μπορούσε να εφαρμοστεί ως διαγνωστικό εργαλείο ιστοευαισθησίας υγιών ατόμων στα γλυκοκορτικοειδή. Στη μελέτη μεταβολικής φαινοτύπησης του καρδιακού ιστού μυός σε συνθήκες χημικής επαγωγής υποθυρεοειδισμού με τη χρήση KClO4 στο πόσιμο νερό BALB/cJ μυών, ανακατασκευάστηκε λεπτομερές δίκτυο αντιδράσεων κεντρικού μεταβολισμού άνθρακα καρδιάς μυός με βάση τα μεταβολομικά δεδομένα αυτής και προηγούμενων μελετών του εργαστηρίου σε μοντέλα μυός, ενδελεχή εξέταση της βιβλιογραφίας και βιολογικών βάσεων δεδομένων. Η ερμηνεία των μεταβολομικών αποτελεσμάτων στο πλαίσιο αυτού του μεταβολικού δικτύου κατέδειξε διακριτό μεταβολισμό της καρδιάς μεταξύ των δύο φύλων. Αυτή είναι και η αιτία διαφορετικής αντίδρασής τους στον υποθυρεοειδισμό, που χαρακτηρίζεται από μείωση των επιπέδων γλυκόζης και άλλων μεταβολιτών προερχόμενοι από το αίμα. Στους αρσενικούς μύες, ο μεταβολισμός της καρδιάς βασίζεται κατά κύριο λόγο στην οξείδωση της γλυκόζης και λιγότερο στην οξείδωση των λιπιδίων, σε αντίθεση με τους θηλυκούς. Αυτό πιθανότατα αιτιολογεί γιατί ο μεταβολισμός του καρδιακού ιστού των θηλυκών δεν επηρεάζεται στην αρχή της επαγωγής (δηλ. στις 45 ημέρες χορήγησης KClO4), ενώ στα αρσενικά έχει αρχίσει η επαγωγή του οξειδωτικού στρες και ο καρδιακός ιστός αντιδρά με αύξηση της οξείδωσης των λιπιδίων και αναπλήρωσης του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Στο πιο προχωρημένο στάδιο της φυσιολογίας (δηλ. στις 60 ημέρες χορήγησης), και ο καρδιακός ιστός των θηλυκών βρίσκεται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες, που υποδηλώνεται από την αύξηση της οξείδωσης των λιπιδίων, αναπλήρωσης του TCA κύκλου, του μεταβολισμού ενός άνθρακα και της οξείδωσης της γλυκόζης.Στα αρσενικά, ο καρδιακός ιστός είναι σε πιο προχωρημένο στάδιο οξειδωτικού στρες, αντιδρώντας με την παραγωγή αντιοξειδωτικών μορίων και οξείδωση των γλυκολιπιδίων. Σημειώνεται ότι είναι η πρώτη φορά που καταδεικνύεται αυτή η διαφορά μεταξύ του μεταβολισμού του καρδιακού ιστού ανάμεσα στα δύο φύλα ως η βασική αιτία διαφορετικής απόκρισης στον υποθυρεοειδισμό και σε διαφορετικά στάδια επαγωγής του. Η ανάλυση του μεταβολικού προτύπου εγκεφαλικών περιοχών στις 45 ημέρες χορήγησης παρατηρήθηκε ότι ο αρσενικός μεσεγκέφαλος, ιππόκαμπος και ραβδωτό, αλλά και ο θηλυκός μεσεγκέφαλος και ιππόκαμπος, εμφανίζονται επηρεασμένοι από την διαταραχή συγκριτικά με την ομάδα αναφοράς. Τέλος, οι φυλοειδικές διαφορές καταδεικνύουν την ανάγκη διερεύνησής τους και διακριτής αντιμετώπισης των δύο φύλων ως προς αυτές για την διάγνωση και αντιμετώπιση διαταραχών με κατάλληλα προσαρμοσμένες αγωγές και φάρμακα. Η μελέτη συνέβαλε στην εξέλιξη της γνώσης σχετικά με τα μεταβολικά μονοπάτια ρυθμιστικής αλληλεπίδρασης μεταξύ ιστών, παρέχοντας περισσότερες πληροφορίες για την ανακατασκευή ενός ευρύτερου μεταβολικού μοντέλου που να περιγράφει αξιόπιστα τη μεταβολική φυσιολογία μυός σε επίπεδο οργανισμού, και υπογραμμίζει τη σημασία της συνεκτίμησης των διαφορών φύλου στις έρευνες παθοφυσιολογίας του υποθυρεοειδισμού.
  • ItemOpen Access
    Ποικιλότητα ειδών, οικοτόπων, οικοσυστημάτων και οικοσυστημικές υπηρεσίες στο Εθνικό Πάρκο Χελμού-Βουραϊκού
    (2022-06-30) Κουμούτσου, Ελένη; Koumoutsou, Eleni
    Η καταγραφή, αξιολόγηση και κατανόηση του φυσικού κεφαλαίου και των παρεχόμενων οικοσυστημικών υπηρεσιών, αποτελεί πρωταρχικής σημασίας στόχο για τη λήψη διαχειριστικών μέτρων και πολιτικών αποφάσεων για την προστασία και ανάδειξη του φυσικού πλούτου και της ανθρώπινης ευημερίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάζεται το φυσικό κεφάλαιο και οι οικοσυστημικές υπηρεσίες στην Προστατευόμενη Περιοχή του Εθνικού Πάρκου και Παγκόσμιου Γεωπάρκου Χελμού-Βουραϊκού της UNESCO (Β. Πελοπόννησος), μέσω της υλοποίησης μελέτης των οικοσυστημικών υπηρεσιών σε τοπική κλίμακα, σύμφωνα με τον Στόχο 2, της Δράσης 5 της Ευρωπαϊκής Στρατηγικής για τη Βιοποικιλότητα. Πιο συγκεκριμένα, με τη χρήση των οδηγιών και της τυπολογίας που προτείνονται για την Ευρωπαϊκή Ένωση, την ανασκόπηση των διαθέσιμων, σχετικών δεδομένων και τις εργασίες πεδίου και τη χρήση της πλατφόρμας MAES_GR, πραγματοποιήθηκαν τα εξής: (α) καταγράφηκαν γεωχωρικά και αναγνωρίστηκαν τα βιοφυσικά χαρακτηριστικά της περιοχής του πάρκου και συγκεκριμένα η χλωριδική ποικιλότητα συνδέθηκε με τη γεωποικιλότητα, την κατάσταση του οικοσυστήματος και τις σχετικές οικοσυστημικές υπηρεσίες, (β) αναγνωρίστηκε γεωχωρικά και περιγράφηκε η κατάσταση των τύπων οικοσυστημάτων, (γ) αναγνωρίστηκαν γεωχωρικά και περιγράφηκαν οι παρεχόμενες, ζητούμενες και δυνητικά παρεχόμενες οικοσυστημικές υπηρεσίες (προμηθευτικές, ρυθμιστικές και διατήρησης, πολιτισμικές), με τη δημιουργία δεικτών αξιολόγησης. Τα κύρια αποτελέσματα αφορούν στη χαρτογράφηση των τύπων οικοσυστημάτων στο Εθνικό Πάρκο Χελμού-Βουραϊκού που αναδεικνύουν την ποικιλομορφία της περιοχής και αναγνωρίζεται η αξία της συνύπαρξης των ανθρωπογενών χρήσεων γης με το καθεστώς προστασίας της περιοχής. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη επιστημονικά τεκμηριωμένων συμπερασμάτων και προτάσεων, υποστηρίζοντας τις τοπικές και εθνικές προσπάθειες για την εφαρμογή της Στρατηγικής για τη Βιοποικιλότητα και καθοδηγώντας τη διαχείριση των χρήσεων γης και τον χωροταξικό σχεδιασμό στην προστατευόμενη περιοχή.
  • ItemOpen Access
    Study of the endogenous cortical activity : the role of GABAergic and cholinergic neurotransmission in the physiology and pathophysiology of the brain’s neuronal networks
    Kaplanian, Egis Ani; Καπλανιάν, Εγίς Ανί
    Slow oscillations, the hallmark of non-REM sleep, and their cellular counterpart, Up and Down states, are considered a signature of cortical dynamics that reflect the intrinsic network organization. Although previous studies have explored the role of inhibition in regulating Up and Down state activity, little is known about whether this role changes with maturation. This is surprising since both slow oscillations and Up and Down states exhibit significant age-dependent alterations. Furthermore, despite the fact that cholinergic neuromodulation is a crucial regulator of cortical microcircuits’ properties and excitation-inhibition balance, the implication of cholinergic wiring in Up and Down states modulation is poorly studied. To elucidate the developmental impact of GABAb and GABAa receptors on Up and Down state activity, we conducted simultaneous extracellular and intracellular recordings ex vivo, in brain slices of young and adult male mice, using selective blockers, CGP and non-saturating concentration of gabazine, respectively. Blockade of both GABAb- and GABAa- signaling showed age-differentiated functions. CGP caused an increase in Down state duration in young animals, but a decrease in adults. Gabazine evoked Spike-and-Wave-Discharges in both ages; however, while young networks became completely epileptic, adults maintained the ability to generate Up and Down states. Furthermore, voltage clamp recordings of mIPSCs revealed that gabazine selectively blocks phasic currents, particularly involving postsynaptic mechanisms. The latter exhibit clear maturational changes, suggesting a different subunit composition of GABAa receptors between young and adult animals. Indeed, subsequent LFP recordings under diazepam (nanomolar or micromolar concentrations) revealed that mechanisms engaging the drug’s classical-binding-site, mediated by α1-subunit containing GABAa receptors, have a bigger contribution in Up state initiation in young networks compared to adults. In the continuum of our study, we strived to illuminate the role of α5-containing nicotinic acetylcholine receptors (α5* nAChRs) in the generation and maintenance mechanisms of Up and Down states. For this purpose we conducted simultaneous extracellular and intracellular recordings ex vivo in brain slices of young mice from two genotypes (wild type and a5-nACh receptor subunit knockout-ACNA5 Chrna5 or α5-/-) and observed a significant genotype dependent effect on Up and Down state activity: ACNA5 networks turned sluggish with alternating periods of shorter and less frequent Up states and longer Down states compared to wild type. To further elucidate the physiological properties of the ACNA5 microcircuit, we conducted voltage-clamp recordings from layer II/III pyramidal neurons. We showed that these cells receive significantly elevated levels of action-potential dependent inhibitory input which has possibly led to up regulation of synaptic GABAa receptor expression. Subsequent application of CGP and gabazine shed light on an interesting interplay only between α5-nACh receptors and GABAa receptors: blockade of synaptic fast inhibition did not affect ACNA5 networks which kept transiting in physiological Up and Down states, while wild type turned epileptic. Blockade of GABAb receptors had the same effects in the two genotypes, elongation of Up as well as Down states. Taken together, these findings help clarify the mechanisms that underlie the maturation of cortical network activity and enhance our understanding regarding the cortical circuits’ properties in the synchronized slow oscillatory state of the brain.
  • ItemOpen Access
    Ανάπτυξη μεθόδων για την in vivo ποσοτικοποίηση της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου στους οργανισμούς
    Ζησιμόπουλος, Δημήτριος; Zisimopoulos, Dimitrios
    Η μελέτη παρουσιάζει μια νέα μέθοδο που εντοπίζει την ελεύθερη ρίζα O2•−, μέσω ποσοτικοποίησης του 2-υδροξυεθιδίου (2-ΟΗ-Ε+), με ευαισθησία ~30 fmoles με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης (High-Performance Thin Layer Chromatography/ΗPTLC). Η μέθοδος απομονώνει το 2-ΟΗ-Ε+ μετά από την εκχύλισή του με το ανιονικό απορρυπαντικό SDS (σε συγκέντρωση 18 φορές μεγαλύτερη από τη κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση) μαζί με συγκεκριμένα οργανικά/ανόργανα αντιδραστήρια, και το διαχωρισμό του από τα μόρια εθίδιο (Ε+) και διεθίδιο (di-Ε+), μέσω της HPTLC. Η ποσοτικοποίηση του 2-ΟΗ-Ε+ βασίζεται στα μέγιστα ex/em στα 290/540 nm, και για τα E+ και di-E+ στα 295/545 nm. Οι πιο σημαντικές καινοτομίες της παρούσας μεθόδου είναι η ανάπτυξη πρωτοκόλλων για (α) την αποτελεσματική εκχύλιση (με το SDS) και (β) την ευαίσθητη ποσοτικοποίηση (με την HPTLC) του 2-OH-E+ (καθώς και των E+ και di-E+) από τα περισσότερα βιολογικά συστήματα (ζώα, φυτά, κύτταρα, υποκυτταρικά οργανίδια, υγρά). Η μέθοδος εκχυλίζει το 2-ΟΗ-Ε+ (εξουδετερώνοντας τους ισχυρούς δεσμούς μεταξύ των τεταρτοταγών τους N+ και των αρνητικά φορτισμένων ομάδων στα φωσφολιπίδια, το DNA κ.λπ.) μαζί με το υδροεθίδιο (HE), προστατεύει και τα δύο μόρια από βιολογικές οξειδάσες, ενώ εκχυλίζει/ποσοτικοποιεί τις ολικές πρωτεΐνες (υδρόφιλες/υδρόφοβες) για να εκφράζονται τα επίπεδα της ελεύθερης ρίζας O2•− ανά βάρος πρωτεΐνης. Επίσης, η μέθοδος χρησιμοποιεί επίσης το SDS (σε συγκέντρωση 80 φορές μικρότερη από τη CMC) για να εκχυλίσει/απομακρύνει/πλύνει το 2-ΟΗ-Ε+ από την εξωτερική μεμβράνη κυττάρων/οργανιδίων και έτσι να ποσοτικοποιείται με ακρίβεια το εσωτερικό περιεχόμενο του 2-ΟΗ-Ε+. Η νέα μέθοδος εφαρμόστηκε σε ενδεικτικά βιολογικά συστήματα, στα οποία η πρόκληση του οξειδωτικού stress (καταπόνηση) έγινε: (1) με τεχνητό τρόπο μέσω της χορήγησης σε ποντικούς της ουσίας paraquat, η οποία είναι γνωστή για τις οξειδωτικές ιδιότητες και την επαγωγή ελευθέρων ριζών, και (2) με φυσιολογικό τρόπο σε φύλλα κουνουπιδιού μέσω της έκθεσής τους σε φως.
  • ItemOpen Access
    Phylogeny and biogeography of Campanula L. section Quinqueloculares (Boiss.) Phitos (Campanuloideae, Campanulaceae)
    Λιβέρη, Ελένη; Liveri, Eleni
    Campanula (Campanuloideae, Campanulaceae) is a one of the most speciose and variable genera including ca. 400 species, which are distributed across the circumboreal region. It is characterized by a long and complex taxonomic history. Traditional classifications were based on morphological characters that often resulted in artificial grouping. The last two decades, however, extensive phylogenetic studies of the broader Campanuloideae utilizing molecular data and modern analytical methods have been presented. These studies have revealed many interesting patterns and insights into the evolution of Campanuloideae and have provided compelling evidence for the polyphyly of Campanula. Mediterranean hotspots for the genus such as the Middle East, Greece, and the Balkan Peninsula are particularly species-rich and have attracted much attention from botanists. Campanula section Quinqueloculares, as traditionally defined, belongs to C. subgenus Campanula and consists of ca. 39 species, which are distribibuted mainly in Greece and W Turkey with high number of endemics. One species is distributed in Italy and France, while two species have been recorded to Caucasus and Middle East. The section is considered one of the most morphologically variable groups in Campanula comprising biennial (monocarpic) or, more rarely, perennial chasmophytes, characterized by a 5-locular ovary, a style with five stigmas, appendages more or less covering the ovary, and a capsule opening with five pores. The main common taxonomic feature was the 5-locular ovary; even though a small group of species with trilocular ovary was recorded. The few early evolutionary hypotheses for C. sect.Quinqueloculares were based on morphological, karyological and biogeographical data resulting to a correlation with paleogeographical events in the Aegean area. From phylogenetic point of view, almost the half species of C. sect.Quinqueloculares, which were included in broader Campanula frameworks, were recoverd into a large but completely unresolved clade of Campanula and related genera (CAM17) mostly growing in Greece, Turkey and Caucasus. However, the comb-like structure of CAM17 to a large extent does not allow generating clear hypotheses on the evolution of C. sect. Quinqueloculares. Main obstacles for the phylogenetic studies were the incomplete taxon sampling and the insufficient molecular markers for this section. Furthermore, the absence of a phylogenetic study focused on C. sect. Quinqueloculares in addition to the few available evolutionary hypotheses formulated several decades ago, render C. sect. Quinqueloculares as a challenging case within CAM17, and presumably a key group for the interpretation of the evolutionary processes in the whole clade. The current PhD Thesis is focused on the study of C. sect. Quinqueloculares employing different methods and evaluating various perspectives. A complete taxon sampling is achived through field work throughout Greece and collaborations with Universities and Herbaria of other countries. The main goals of the study include testing the monophyly and reconstructing the phylogeny of C. sect. Quinqueloculares. In this framework, we aim to infer the historical biogeographic patterns and to reveal the significant biological and geological processes that may have shaped the evolution of this group. In order to accomplish these goals, molecular data for every taxon are obtained whereas the taxonomic contribution of morphological, palynological, and karyological features of most taxa are considered. The photosynthetic traits of C. sect. Quinqueloculares are also evaluated. The comparative morphological study of C. sect. Quinqueloculares and the recording of their main morphological features are based on collected material and herbarium specimens of all described until now taxa. The morphological diversity of the section is very high, especially for some species-complexes, and our results reinforce the already expressed opinions for “extreme polymorphism”. However, some species such as C. laciniata and C. merxmuelleri are particularly distinct. The complexes of C. lyrata, C. rupestris and C. topaliana are found the most variable morphologically; thus, requiring further taxonomic reconsiderations. The re-establishment of C. nisyria as distinct species and not synonym with any species of C. lyrata complex, is well-evident from its morphological traits corroborated by molecular data. Regarding C. topaliana complex, the subsp. topaliana and subsp. cordifolia probably should be merged based on morphological and molecular data. The study of C. rupestris complex, characterized by a consistent 3-locular ovary, revealed high variation on number of ovary locules (from 3 to 5) rendering the number of ovary locules as a diagnostic feature questionable. Seed and pollen morphology of C. sect. Quinqueloculares is examined using Scanning Electron Microscopy and their taxonomic significance is evaluated. The study of seed morphology provides data on size, shape, color and seed coat of 16 Greek taxa. The seed morphology is found to be relatively uniform except the seed coat. The seeds are characterized of small size, oblong to elliptic/obelliptic shape and light to dark brown color. However, two different patterns are described based on the nearness of striations on the seed surface: a) regularly striate and b) narrowly striate. All the data for seed morphology are presented for first time here. The pollen morphology of 12 taxa from C. sect. Quinqueloculares is studied revealing spheroidal, radially symmetrical and isopolar pollen grains with three pores for all taxa. The size of pollen grains is small with the exception of C. laciniata, which has medium-sized grains. The pollen ornamentation shows considerable variation resulting to two different types: a) striato-reticulate and microechinate in most studied taxa and b) rugulate and echinate pollen grains observed in C. laciniata and C. pelviformis. The palynological results are newly generated for 10 of the 12 studied taxa. Although, data for more taxa are needed, the two types of pollen ornamentation seem to support phylogentic relationships in some cases. Overall, seed and pollen morphology are found to be an overlooked feature in Greek Campanula taxa. However, this study sets the framework for their research and additionally supports their complementary role in Campanula taxonomy and systematic mainly at specific rank. The determination of chromosome number, ploidy level and karyomorphometric analysis is presented for 12 taxa of Campanula section Quinqueloculares employing the classical squash technique and combination of stains. The chromosome number 2n = 2x = 34 predominates in all examined taxa with the exception of C. laciniata, for which a new chromosome number (2n = 4x = 68) was found in a population from W Crete. The karyotypes in all examined taxa are symmetrical comprising of mostly metacentric and submetacentric chromosomes, small in size, but they differ in the presence and the size of satellites. The chromosome count (2n = 34) and karyotype morphology of C. topaliana subsp. delphica is given for first time. New populations of C. cymaea, C. kamariana, C. pelviformis, and C. topaliana subsp. cordifolia were karyologically investigated confirming the previous references. The karyotype morphology of C. anchusiflora, C. andrewsii subsp. hirsutula, C. kamariana, C. lavrensis, C. merxmuelleri, C. nisyria and C. rupestris is given for first time. Additionally, microphotographs are firstly provided hereby for all investigated taxa. The taxonomic value of chromosome data for C. sect. Quinqueloculares is limited due to the almost constant chromosome number (2n = 34), the similar chromosome morphology and the small chromosome size, which renders the karyomorphometric analysis extremely difficult. However, the karyological study of more populations is necessary since it may reveal important evolutionary processes, e.g. polyploidy, as in the case of C. laciniata. The molecular study of Campanula section Quinqueloculares utilizes individual and combined data matrices consisting of six plastid (NADHS-2, rpoC1-1, rpoC2-1, rpoC2-2, rpoC2-3, trnT-trnL) and four nuclear (2017561, ITS, PPR11, PPR70) markers for 121 taxa in total. The results indicate that C. sect. Quinqueloculares, as traditionally circumscribed, is polyphyletic. The topology of the phylogenetic trees of chloroplast markers, ITS and 2017561, as well as of combined data is similar. The nuclear markers of PPR family genes show slightly different topology in their phylogenetic trees, but the species of sect. Quinqueloculares are found again scattered in different branches. Species are largely clustered into two well-supported clades, except for three taxa (C. crispa, C. medium, C. pelia) excluded from these groups. Additionally, a few taxa (C. isaurica, C. koyuncui, C. sartorii, C. teucrioides) belonging to other sections are confidently nested within the two Quinqueloculares clades. The first clade (Greek clade) includes one isophylloid species (C. sartorii) nested with 24 Greek endemics belonging to C. sect. Quinqueloculares, which are distributed in mainland Greece, Evia, Northen Sporades and Kiklades islands. Only two species of the clade, ie. C. merxmuelleri and C. saxatilis subsp. saxatilis, extend their distribution to NE Aegean islands and Crete, respectively. C. sartorii, endemic to Kiklades (Andros, Tinos), was not considered member of the traditional circumscribed sect. Quinqueloculares, but our results indicate it always nested within this clade. The second clade (Southeastern Aegean-Turkish clade) comprises 20 taxa of C. sect. Quinqueloculares and 3 species of C. sect. Rupestres, all distributed in E Aegean islands, Crete, Karpathos-Saria and Turkey. The Turkish endemics C. isaurica, C. koyuncui and C. teucrioides were traditionally classified under sect. Rupestres, but in our phylogenetic analyses are resolved within this clade together with Quinqueloculares taxa. Divergence time estimates suggest that these clades originated in the Late Miocene. Temporal and geographic patterns are consistent with a vicariant scenario driven by geological events during the Miocene, such as the formation of the Mid-Aegean trench and the Messinian salinity crisis. The response of various indices of the photosynthetic machinery efficiency to temperature change was examined in species of sect. Quinqueloculares both experimentally in the laboratory (15°C, 24°C, 35°C) and seasonally in the field (winter, spring, summer). The methods of chlorophyll fluorescence and leaf reflectance spectrometry were used. According to the results, the photosynthetic machinery of the studied taxa of the sect. Quinqueloculares is generally more sensitive to high temperatures in the laboratory and respectively during summer in the field. The effect is most pronounced in C. pelviformis and C. merxmuelleri. The low winter temperature which is generally considered as a second stressful parameter for Mediterranean plants does not seem to be particularly stressful for the studied species. Concluding, after decades of attempts to clarify the evolutionary history of Campanula at broad and narrow scales, it seems that we are still far from a comprehensive understanding of this enigmatic group. In order to resolve the taxonomic complexity and elucidate the historical evolution of Campanula in the Mediterranean region and beyond, more focused studies with increased genomic data and complete taxon sampling are necessary. The current PhD represents the first phylogenetic study focused on C. sect. Quinqueloculares and based on complete taxon sampling, 10 molecular markers as well as data on morphology, palynology, karyology and ecophysiology in a taxonomic context. The results reveal the polyphyletic origin and intriguing evolutionary aspects of C. sect. Quinqueloculares, which comprise an important piece of Campanula evolutionary history and also set the background for a new classification of the section in a phylogenetic context.