Τμήμα Βιολογίας (ΔΔ)

Permanent URI for this collection

Browse

Recent Submissions

Now showing 1 - 5 of 188
  • Thumbnail Image
    Item
    Embargo
    Ο ρόλος του ορφανού πυρηνικού υποδοχέα NR5A2 στις νεοπλασίες του νευρικού συστήματος
    Γκίκας, Δημήτριος; Gkikas, Dimitrios
    Οι κακοήθειες του νευρικού συστήματος χαρακτηρίζονται από ταχεία εξέλιξη και χαμηλά ποσοστά επιβίωσης. Αυτές οι κλινικές παρατηρήσεις υπογραμμίζουν την ανάγκη για εξέρευση νέων φαρμακολογικών στόχων και θεραπευτικών προσεγγίσεων. Προς αυτό το στόχο και στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας προσδιορίσαμε τον ορφανό πυρηνικό υποδοχέα NR5A2/LRH1 ως αρνητικό ρυθμιστή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και ως ένα πολλά υποσχόμενο φαρμακολογικό στόχο για τους όγκους που σχετίζονται με το νευρικό σύστημα. Ειδικότερα, βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από όγκους ασθενών διαθέσιμων σε βάσεις δεδομένων, όπως οι Oncomine και TCGA (The Cancer Genome Atlas), δείχνουν ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του NR5A2 σχετίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση σε ασθενείς με όγκους γλοιοβλαστώματος και νευροβλαστώματος. Στη συνέχεια, με μία σειρα πειραμάτων υπερέκφρασης δείξαμε ότι το NR5A2 είναι επαρκές για να καταστείλει έντονα τον πολλαπλασιασμό τόσο των ανθρώπινων όσο και των ποντικίσιων κυττάρων γλοιοβλαστώματος και νευροβλαστώματος χωρίς να επάγει την απόπτωση τους. Επιπλέον, η καταστολή της έκφρασης του NR5A2, με τη χρήση ειδικών shRNA φορέων, προάγει τον πολλαπλασιασμό και τον κυτταρικό κύκλο των κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Επίσης, η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του NR5A2 διαμεσολαβείται από τη μεταγραφική επαγωγή των αρνητικών ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, CDKN1A (που κωδικοποιεί την p21cip1), CDKN1B (που κωδικοποιεί την p27kip1) και Prox1. Στο πλαίσιο της φαρμακολογικής στόχευσης αυτού του μορίου δείξαμε ότι δύο καθιερωμένοι αγωνιστές του NR5A2, η διλουροϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DLPC) και η διουνδεκανοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DUPC), είναι σε θέση να μιμηθούν την αντι-πολλαπλασιαστική δράση του NR5A2 σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος μέσω της επαγωγής των ίδιων κρίσιμων γονιδίων. Η πιο σημαντική μας παρατήρηση όμως είναι ότι ένας από αυτούς τους αγωνιστές, ο DLPC, είναι αφενός ικανός να περάσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και αφετέρου να καταστείλει την ανάπτυξη των όγκων του γλοιοβλαστώματος in vivo σε ετεροτοπικά και ορθοτοπικά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικών. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν έναν ογκοκατασταλτικό ρόλο του NR5A2 στο νευρικό σύστημα και καθιστούν αυτόν τον πυρηνικό υποδοχέα δυνητικό φαρμακολογικό στόχο για τη θεραπεία όγκων που σχετίζονται με τον νευρικό ιστό.
  • Thumbnail Image
    Item
    Open Access
    Μελέτη της αύξησης μικροφυκών σε ανακυκλώσιμα νερά ιχθυοτροφείων και παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας
    Ντούρου, Μαριάννα; Dourou, Marianna
    H βιομάζα των μικροφυκών είναι πλούσια σε βιοδραστικές ενώσεις υψηλού βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος, με πολλαπλές εμπορικές εφαρμογές κι έτσι τα τελευταία χρόνια η καλλιέργειά τους σε μεγάλη κλίμακα έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον ερευνητών και παραγωγικών μονάδων. Ωστόσο, η βιωσιμότητα της διαδικασίας επηρεάζεται αρνητικά από το υψηλό κόστος του μέσου καλλιέργειας και από τους τεράστιους όγκους νερού οι οποίοι απαιτούνται για την καλλιέργεια μικροφυκών. Από την άλλη, ο κλάδος της υδατοκαλλιέργειας, ολοένα και αυξανόμενος, συνδέεται με επιβλαβείς επιπτώσεις στους υδροφόρους ορίζοντες, εξαιτίας των υγρών αποβλήτων τα οποία παράγει. Αποτελεσματική εναλλακτική προσέγγιση για την αύξηση της βιωσιμότητας της διαδικασίας αποτελεί η αξιοποίηση των υγρών αποβλήτων υδατοκαλλιέργειας ως μέσο ανάπτυξης μικροφυκών. Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, παραλήφθηκαν τρία υγρά απόβλητα από δεξαμενές εκτροφής ιχθύων διαφορετικού σωματικού βάρους από Ελληνική μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας και ένα ακόμη από την κεντρική δεξαμενή καθίζησης της ιδίας εταιρίας. Σύμφωνα με τα προκαταρκτικά πειράματα, το απόβλητο προερχόμενο από τη δεξαμενή καθίζησης (effluent from the sedimentation tank, EST) αποδείχθηκε το καταλληλότερο να υποστηρίξει την αύξηση του μικροφύκους Nannochloropsis gaditana, σε καλλιέργειές του σε κωνικές φιάλες. Η χημική του σύσταση εμφάνισε εξάρτηση από το μέγεθος των εκτρεφόμενων ιχθύων. Πιο συγκεκριμένα, μήνες κατά τους οποίους στη μονάδα εκτρέφονταν ιχθύες μικρού σωματικού βάρους, στη δεξαμενή καθίζησης κατέληγαν λύματα πλούσια σε φώσφορο (P), έτσι ο ο λόγος Ν/P του αποβλήτου σε μία περίοδο παραλαβής ήταν 20,9 (μοναδική τιμή). Αντίθετα, όταν εκτρέφονταν ιχθύες μεγάλου σωματικού βάρους, στη δεξαμενή καθίζησης κατέληγαν λύματα στα οποία ο P βρισκόταν σε πενία, ενώ οι αζωτούχες ενώσεις σε περίσσεια. Συγκεκριμένα, σε δύο περιόδους παραβής, ο λόγος N/P ισούνταν με 1333,4 και 298,4 (μοναδικές τιμές). Βάσει των ανωτέρω, τα απόβλητα της ιχθυοκαλλιέργειας χαρακτηρίστηκαν στην παρούσα διατριβή ως πλούσια (EST_P+) και περιοριστικά (EST_P-) σε φώσφορο. Σύμφωνα με προκαταρκτικά πειράματα καλλιέργειας μικροφυκών σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer υπό συνεχή φωτισμό και περιοδική ανάδευση, η ανάπτυξη των στελεχών N. oculata και Nannochloropsis sp. παρεμποδίστηκε από τη χημική σύσταση του EST_P+, ενώ τα είδη N. atomus, N. gaditana, Tetraselmis suecica και Tisochrysis lutea αναπτύχθηκαν ικανοποιητικά σε αυτό. Τα ικανά να αναπτυχθούν στο EST_P+ στελέχη μικροφυκών καλλιεργήθηκαν σε δύο τύπους εργαστηριακού φωτο-βιοαντιδραστήρα υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι, προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση διαφόρων παραμέτρων στην αύξηση και τη φυσιολογία τους. Στον προσομοιάζοντα με ανοικτή δεξαμενή φωτο-βιοαντιδραστήρα (open pond simulationg reactor, OPSR) η ροή παροχής αέρα ήταν 150 L/h, η ένταση φωτισμού 245 μmol m-2 s-1 και η ανάδευση πραγματοποιούνταν μέσω μικρής αντλίας με ροή 150 L/h. Από την άλλη, στον φωτο-βιοαντιδραστήρα κλειστού τύπου (stirred tank reactor, STR) η ροή παροχής αέρα ήταν χαμηλότερη (= 37,5 L/h), η ένταση του φωτός ισχυρότερη (= 1636 μmol m-2 s-1) και η ανάδευση πιο ομοιόμορφη, κάτι το οποίο εξασφαλιζόταν από τα δύο στροφεία ανάδευσης έξι περιστρεφόμενων πτερυγίων, τα οποία διαθέτει ο βιοαντιδραστήρας. Επίσης πραγματοποιήθηκαν και καλλιέργειες-ελέγχου των ανωτέρω στελεχών μικροφυκών στον φωτο-βιοαντιδραστήρα OPSR σε μέσο καλλιέργειας τεχνητό θαλασσινό νερό (artificial seawater, ASW) περιοριστικό σε φώσφορο (ASW_P-), το οποίο έχει χαμηλότερη αλατότητα (= 27,0 g/L) από το υγρό απόβλητο. Η μέγιστη παραγωγή ξηρής βιομάζας (dry cell mass, x) από το είδος N. gaditana (x = 847,0 mg/L με παραγωγικότητα Px = 180 mg/L*d) παρατηρήθηκε όταν καλλιεργήθηκε σε μέσο καλλιέργειας EST_P+ στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR. Αντίθετα, η μέγιστη συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας (lipids in the dry cell mass, L/x), δηλαδή L/x = 24,7%, παρατηρήθηκε όταν το στέλεχος καλλιεργήθηκε σε μέσο ανάπτυξης EST_P-. Έτσι, και τα υπόλοιπα υπό μελέτη στελέχη μικροφυκών καλλιεργήθηκαν σε περιοριστικό σε P απόβλητο. Η πενία P σε συνδυασμό με την υψηλή αλατότητα του EST_P- επηρέασε αρνητικά την παραγωγή ξηρής βιομάζας συγκριτικά με τις καλλιέργειές τους στο ASW_P-, στον φωτο-βιοαντιδραστήρα OPSR. Πιο συγκεκριμένα, το N. atomus παρήγαγε x = 84,0 mg/L (έναντι 156,3 mg/L στο ASW_P-), το T. suecica x = 263,3 mg/L (έναντι 724,0 mg/L στο ASW_P-) και το T. lutea x = 128,1 mg/L (έναντι 193,1 mg/L στο ASW_P-). Η παραγόμενη βιομάζα ωστόσο, ήταν περισσότερο πλούσια σε αποθεματικά μόρια. Συγκεκριμένα, ευνοήθηκε σημαντικά η συσσώρευση λιπιδίων και πολυσακχαριτών (polysaccharides in the dry cell mass, S/x) στο είδος N. atomus, αφού L/x = 36,2 και S/x = 33,8% (έναντι 11,7 και 8,7%, αντίστοιχα στο ASW_P-). Παρόμοια, το T. lutea συσσώρευσε L/x = 36,5 και S/x = 26,8% καλλιεργούμενο στο EST_P- (έναντι 16,4 και 9,6%, αντίστοιχα στο ASW_P-). Στο είδος T. suecica επηρεάστηκε σημαντικά μόνο η συσσώρευση πολυσακχαριτών (S/x = 42,9% στο EST_P-). Το περιεχόμενο σε πρωτεΐνες (proteins in the dry cell mass, P/x) δεν επηρεάστηκε από το μέσο καλλιέργειας και παρέμεινε σε υψηλά ποσοστά σε κάθε περίπτωση. Το απόβλητο EST_P- επηρέασε τη σύσταση των ολικών λιπιδίων (total lipids - TL) σε λιπιδιακά κλάσματα, κι έτσι στα TL των N. gaditana, N. atomus και T. suecica υπερέχον λιπιδιακό κλάσμα ήταν αυτό των ουδέτερων λιπιδίων (neutral lipids, NL). Αντίθετα, κατά την καλλιέργειά τους στο ASW_P- υπερέχον λιπιδιακό κλάσμα ήταν αυτό των γλυκο- και σφιγγολιπιδίων (glycolipids + sphingolipids, G+S). Τέτοια επίδραση δεν παρατηρήθηκε στα TL του T. lutea. Επιπροσθέτως, το αποβλήτο επηρέασε το προφίλ σε λιπαρά οξέα των TL και την κατανομή των λιπαρών οξέων στα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα, αφού αναστάλθηκε η βιοσύνθεση των n-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) και ο δείκτης ακορεστότητας (unsaturated index, U.I.), όπως και ο λόγος n-3/n-6 εμφάνισαν μειωμένες τιμές στα TL και τα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα των ειδών N. gaditana, N. atomus και T. suecica. Εξαίρεση αποτέλεσε το στέλεχος T. lutea, στο οποίο τα ΣPUFAs και Σn-3 αυξήθηκαν στα πολικά κλάσματα κατά την καλλιέργειά του στο απόβλητο. Παρά την υψηλή ένταση φωτισμού, η οποία επικρατούσε στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR, δεν παρατηρήθηκαν φαινόμενα αναστολής της αύξησης για κανένα από τα υπό εξέταση μικροφύκη. Αντίθετα, οι συνθήκες οι οποίες επικρατούσαν στον STR ευνόησαν την παραγωγή ξηρής βιομάζας συγκριτικά με τις συνθήκες στον OPSR, ενώ η συσσώρευση αποθεματικών μορίων παρέμεινε σε υψηλά ποσοστά και αυτό ισχύει για όλα τα μικροφύκη, καλλιεργούμενα στο EST_P-. Ωστόσο, το σύστημα καλλιέργειας επηρέασε τη σύσταση των λιπιδίων και λιπιδιακών κλασμάτων σε λιπαρά οξέα. Οι συνθήκες ανάπτυξης στον φωτο-βιοαντιδραστήρα STR ευνόησαν τη βιοσύνθεση του C14:0 από το N. gaditana και του C18:3 n-3 από το N. atomus, ενώ παρατηρήθηκε αναστολή της βιοσύνθεσης του C18:1 n-7 από το T. suecica και του C14:1 n-5 από το T. lutea. Μελετήθηκε επίσης η επίδραση της φωτοπεριόδου στην παραγωγή βιομάζας και μεταβολικών προϊόντων από το μικροφύκος N. gaditana καλλιεργούμενο σε μέσο ανάπτυξης EST_P-. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, υπό φωτοπερίοδο 12 h φως : 12 h σκοτάδι δεν ευνοήθηκε η αύξηση του μικροφύκους (x = 62,8 mg/L). Όμως, η συσσώρευση λιπιδίων επί της ξηρής βιομάζας ευνοήθηκε υπό φωτοπερίοδο 16 h φως : 8 h σκοτάδι (L/x = 30,6%) συγκριτικά με την καλλιέργεια του μικροφύκους υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Στο μικροφύκος N. gaditana, εξετάστηκε επίσης και η επίδραση του αρχικού εμβολίου και αποδείχθηκε ότι, ανεξαρτήτως της φωτοπεριόδου, καλλιέργεια η οποία εμβολιάστηκε με μικρό μέγεθος εμβολίου οδήγησε σε χαμηλότερης πυκνότητας καλλιέργεια, χαμηλότερη συγκέντρωση παραγόμενης βιομάζας, πλουσιότερης ωστόσο σε αποθεματικά μόρια (λιπίδια και πολυσακχαρίτες). Επιπλέον, το μικροφύκος N. gaditana καλλιεργήθηκε σε πιλοτική κλίμακα σε θερμοκρασία χαμηλότερη από αυτήν που επικρατούσε στις μελέτες στο εργαστήριο (T = 20 °C), σε μέσο ανάπτυξης EST_P-, υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Η παραγόμενη βιομάζα κρίθηκε ικανοποιητική (x = 403,7 mg/L), όμως το μικροφύκος συσσώρευσε σε χαμηλά ποσοστά αποθεματικά συστατικά (L/x = 10,1 και S/x = 6,4%). Ωστόσο, η χαμηλή θερμοκρασία ευνόησε τη βιοσύνθεση του λιπαρού οξέος C20:5 n-3 τόσο στα TL, όσο και στα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν επίσης η μελέτη της ικανότητας αυτότροφου μικροοργανισμού να δεσμεύσει και να αξιοποιήσει το παραγόμενο από καλλιέργεια ετερότροφου μικροοργανισμού CO2. Στέλεχος της ελαιογόνου ζύμης Yarrowia lipolytica καλλιεργήθηκε στον βιοαντιδραστήρα STR και τα παραγόμενα από το μεταβολισμό αέρια της ζύμης χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή άνθρακα σε καλλιέργειες του μικροφύκους N. gaditana και συγκρίθηκαν με καλλιέργειες-ελέγχου του μικροφύκους, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν με παροχή φυσικού αέρα. Η ζύμη Y. lipolytica καλλιεργούμενη σε σύστημα ημι-συνεχούς λειτουργίας, παρήγαγε 14,7 g/L βιομάζα, 6,1 g/L κιτρικό οξύ, συσσώρευσε L/x = 18,2%, S/x = 35,1%, P/x = 18,8%, και κατά μέσο όρο απελευθέρωνε 5,3 g/L*d CO2, το οποίο από τον 4ο κύκλο αύξησής της διοχευόταν σε δύο ανεξάρτητες μεταξύ τους καλλιέργειες του N. gaditana με ρυθμό παροχής αέρα 45 L/h. Το μικροφύκος καλλιεργήθηκε σε κωνικές φιάλες Erlenmeyer σε μέσο ανάπτυξης ASW_P- υπό φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι. Κατά τις καλλιέργειες-ελέγχου, το πρότυπο της αύξησης του μικροφύκους ήταν γραμμικό, αντίθετα, όταν η καλλιέργεια εμπλουτίστηκε με τα αέρια της ζύμης, το πρότυπο της αύξησης άλλαξε στο τυπικό σιγμοειδές πρότυπο αύξησης υπό τον έλεγχο ενός μόνον περιοριστικού για την αύξηση παράγοντα. Ο ρυθμός δέσμευσης του CO2 (bio-sequestration rate, RCO2) δε διέφερε μεταξύ των συνθηκών αερισμού και η παραγωγικότητα του μικροφύκους, όσον αφορά στην παραγωγή βιομάζας και τη συσσώρευση αποθεματικών μορίων, ήταν χαμηλότερη όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε με παροχή μίγματος αερίων της ζύμης, ενώ η παραγωγή πρωτεϊνών ήταν υψηλότερη. Έπειτα από μικροσκοπική παρατήρηση φάνηκε ότι o εμπλουτισμός με τα αέρια της ζύμης οδήγησε σε μεγαλύτερα σε μέγεθος κύτταρα του μικροφύκους, συγκριτικά με τις καλλιέργειες-ελέγχου. Παρατηρήθηκε επίσης επίδραση στη σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα, καθώς τα TL και τα επιμέρους λιπιδιακά κλάσματα του N. gaditana ήταν περισσότερο πολυακόρεστα, όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε με CO2 προερχόμενο από το μεταβολισμό της ζύμης. Συγκεκριμένα η αύξηση της ακορεστότητας αφορούσε περισσότερο σε αύξηση του λιπαρού οξέος C20:5 n-3. Επιπλέον, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης, αποδεικνύεται ότι η βιοσύνθεση των PUFAs σχετίζεται με την αύξηση των φωτοσυνθετικών μεμβρανών και όχι με τη συσσώρευση ουδέτερων λιπιδίων, αφού C20:5 n-3(G) ήταν >20 mg/gxf , ενώ C20:5 n-3(NL) ήταν <5 mg/gxf και στις δύο συνθήκες αερισμού του N. gaditana. Επιπροσθέτως, μεταξύ των συνθηκών αερισμού δεν επηρεάστηκε σημαντικά η σχετική ενεργότητα της ελονγκάσης στο N. gaditana, αντίθετα της Δ9 αποκορεσμάσης αυξήθηκε σημαντικά στο κλάσμα των NL, ενώ της Δ12 αποκορεσμάσης μειώθηκε στο ίδιο κλάσμα. Και οι δύο αποκορεσμάσες εμφάνισαν υψηλή ενεργότητα στο κλάσμα των G, όταν η καλλιέργεια του μικροφύκους εμπλουτίστηκε με CO2 προερχόμενο από την καλλιέργεια της ζύμης. Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, το είδος N. gaditana επιλέχθηκε για την ανάπτυξη στρατηγικής εργαστηριακής προσαρμοστικής εξέλιξης (adaptive laboratory evolution, ALE). Υποβλήθηκε σε 15 διαδοχικούς αυξητικούς κύκλους, οι οποίοι περιλάμβαναν την ανάπτυξή του σε συνθήκες ευνοϊκές για συσσώρευση αποθεματικών ουσιών (καλλιέργεια για 240 h σε φωτοπερίοδο 24 h φως : 0 h σκοτάδι σε θρεπτικό μέσο ASW_P-), ακολουθούμενες από συνθήκες οι οποίες ευνοούν την αποδόμηση των αποθεματικών υλικών (καλλιέργεια για 240 ή 340 h σε συνθήκες σκότους ή/και απουσία CO2). Τελικά, ο εξελιγμένος/προσαρμοσμένος πληθυσμός μετά από 28,8 γενεές, παρουσίασε κατά 19,6% χαμηλότερο ρυθμό δέσμευσης του CO2 (RCO2 = 24,2 mg/L*d) συγκριτικά με το άγριο στέλεχος, με αποτέλεσμα να παρουσιαστεί μειωμένη κατά 34,4% παραγωγικότητα Px, μειωμένη κατά 8,3% συσσώρευση λιπιδίων, αυξημένη κατά 19,6% παραγωγή πρωτεϊνών, ενώ δεν εμφανίστηκε διαφορά στη συσσώρευση πολυσακχαριτών. Επιπλέον, το κλάσμα των NL μειώθηκε κατά 32,1%, ενώ το κλάσμα των PL αυξήθηκε κατά 160%. Σύμφωνα με τις φωτογραφίες των κυττάρων σε συνεστιακό μικροσκόπιο, παρατηρήθηκε ότι το μέγεθος των χλωροπλαστών μεγάλωσε κατά τις συνθήκες σκότους στους πρώτους αυξητικούς κύκλους, και με την πάροδο των γενεών το μεγάλο μέγεθος διατηρήθηκε και κατά τις συνθήκες φωτός. Επιπλέον, οι χρωστικές «μετακινήθηκαν» προς τις φωτοσυνθετικές μεμβράνες των εξελιγμένων στελεχών του N. gaditana και εκχυλίστηκαν στα πολικά κλάσματα, κυρίως στο κλάσμα των G, και όχι στο κλάσμα των NL, όπως συνέβη για το άγριο στέλεχος. Το προφίλ των TL σε λιπαρά οξέα δεν άλλαξε σε σημαντικό βαθμό. Ωστόσο, ως απόκριση στην εξελικτική πίεση στην οποία υποβλήθηκε το μικροφύκος N. gaditana, το κλάσμα των NL έγινε περισσότερο πλούσιο σε κορεσμένα λιπαρά οξέα (saturated fatty acids, SFAs) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (monosaturated fatty acids, MUFAs), ενώ τα πολικά κλάσματα G και PL έγιναν περισσότερο πλούσια σε ΣPUFAs, με αποτέλεσμα ο δείκτης U.I. να αυξηθεί κατά 35,7 και 83,3% στο κλάσμα των G και PL, αντίστοιχα. Η αύξηση αυτή αφορούσε κυρίως σε αύξηση του C20:5 n-3(PL) από 1,1 mg (άγριο στέλεχος) σε 4,3 mg (εξελιγμένο στέλεχος). Στο τελευταίο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής εξετάστηκε η δυνατότητα ενσωμάτωσης βιομάζας μικρο- και μακροφυκών στο σιτηρέσιο του Ευρωπαϊκού λαβρακιού (Dicentrarchus labrax). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ενσωμάτωση ξηρής βιομάζας του μικροφύκους Nannochloropsis sp. οδήγησε σε αύξηση των n-3 λιπαρών οξέων στην νέα ιχθυοτροφή και ο λόγος n-3/n-6 αυξήθηκε κατά 75% συγκριτικά με την εμπορική ιχθυοτροφή. Η αύξηση αυτή επηρέασε τη σύσταση της σάρκας των ιχθύων, αυξάνοντας το Σn-3 κατά 17,4% και τον λόγο n-3/n-6 κατά 43,8%.
  • Thumbnail Image
    Item
    Embargo
    Μεταβολικές διαταραχές και συστημική βιολογία : εφαρμογή στην αναζήτηση μεταβολικών βιοδεικτών ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή και στη συνδυαστική μεταβολική μελέτη οργάνων ενήλικων υποθυρεοειδικών μυών με μεταβολομική
    (2022-09-09) Ιωαννίδη, Μαρία Κωνσταντίνα; Ioannidi, Maria Konstantina
    Οι μεταβολικές διαταραχές συνδέονται με πλήθος νοσημάτων στον άνθρωπο, που τις καθιστούν από τα σοβαρότερα προβλήματα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται μία ραγδαία αύξηση στο ποσοστό του πληθυσμού που εμφανίζει κακό καρδιομεταβολικό πρότυπο στην ενήλικη ζωή και επηρεάζεται από κάποιου είδους μεταβολική διαταραχή, καθιστώντας αναγκαία την περαιτέρω διερεύνησή των μεταβολικών διαταραχών ως προς τις αιτίες και τους τρόπους αντιμετώπισής τους. Στη σύγχρονη βιολογία και ιατρική, η ολιστική ανάλυση της μοριακής φυσιολογίας πολλών ιστών, είτε μεμονωμένα αλλά και συνδυαστικά, με τη χρήση βιομοριακών αναλύσεων υψηλής απόδοσης (ή αλλιώς ομικών αναλύσεων) μπορεί να παρέχει μία λεπτομερή εικόνα ιστοειδικών χαρακτηριστικών, που συνδέονται με μια μεταβολική διαταραχή αλλά και συνολικών ρυθμιστικών μηχανισμών που εμπλέκουν περισσότερους ιστούς. Ιδιαίτερα, η ολιστική ανάλυση του μεταβολικού προτύπου (μεταβολομική) ιστών στο πλαίσιο αυτών των μεταβολικών παθοφυσιολογιών κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική, με σημαντική συμβολή στη συστημική φυσιολογία εάν αξιοποιηθεί κατάλληλα για μεταφραστικές εφαρμογές. Η μεταβολομική ανάλυση ιστών σε συνθήκες μεταβολικής διαταραχής είναι μια πολυβηματική διαδικασία, που απαιτεί προσεγμένο πειραματικό σχεδιασμό και εκτέλεση όλων των πειραματικών σταδίων, ώστε να αποδώσει αξιόπιστα δεδομένα που να μπορούν να αξιοποιηθούν για την εξαγωγή βιολογικών συμπερασμάτων. Σημειώνεται ότι ως προς τον πειραματικό σχεδιασμό, την επιλογή του κατάλληλου μοντέλου και του δείγματος της μελέτης, και των πειραματικών πρωτοκόλλων προαναλυτικών σταδίων, δηλ. συλλογής και χειρισμού δειγμάτων, και εάν χρειάζεται διαπότισης (perfusion) των ιστών, και των αναλυτικών σταδίων ποσοτικοποίησης του μεταβολικού προτύπου, η μεταβολομική βρίσκεται ακόμα σε στάδιο προτυποποίησης για ένα ευρύ σύνολο τύπων δείγματος, πειραματικών μοντέλων και εφαρμογών. Επίσης, στο υπολογιστικό τμήμα της μεταβολομικής ανάλυσης, η επεξεργασία, το φιλτράρισμα, η κανονικοποίηση και η ανάλυση των δεδομένων απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή και χειρισμό. Τέλος, η ανακατασκευή του μεταβολικού δικτύου που αντιστοιχεί στα μεταβολομικά δεδομένα αποτελεί πρόκληση, καθώς δεν υπάρχουν γενικώς αποδεκτά μεταβολικά μοντέλα για τους ιστούς θηλαστικών, ενώ υπάρχουν πλήθος ανοιχτά ερωτήματα ως προς τις αντιδράσεις που είναι ενεργές σε έναν ιστό και το εάν τα μόρια που προσδιορίζονται είναι ενδογενή ή προέρχονται από άλλους ιστούς στους οποίους παράγονται. H παρούσα διατριβή στόχευσε στην αριστοποιημένη εφαρμογή της μεταβολομικής ανάλυσης, με χρήση χρωματογραφίας αερίων-φασματομετρίας μάζας στο πλαίσιο δύο διακριτών μελετών μεταβολικών διαταραχών, η μια στο πλαίσιο της μεταφραστικής ιατρικής και η δεύτερη σε ζωϊκό μοντέλο. Στην πρώτη μελέτη, διερευνήθηκε η χρησιμότητα της μεταβολομικής ανάλυσης πλάσματος αίματος για τον προσδιορισμό μιας μεταβολικής υπογραφής, διακριτικής υγιών ατόμων ως προς την ιστοευαισθησία τους στα γλυκοκορτικοειδή, όταν δεν φέρουν μεταλλάξεις ή πολυμορφισμούς στο γονίδιο του ανθρώπινου υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (hGR), NR3C. Στην δεύτερη εφαρμογή, μελετήθηκε η επίδραση του χρόνιου υποθυρεοειδισμού ενηλίκων (ΧΥΕ) στον καρδιακό ιστό σε μοντέλο μυός χημικής επαγωγής της φυσιολογίας, και στα δύο φύλα και δύο στάδια χημικής επαγωγής της διαταραχής, διερευνώντας φυλοειδικές διαφορές εξέλιξης της νόσου και συγκρίνοντάς τις με αποτελέσματα μεταβολικής φαινοτύπησης εγκεφαλικών περιοχών των ίδιων ζώων. Η μελέτη ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή ήταν η πρώτη αυτού του είδους διεθνώς και κατέδειξε ότι υπάρχει διακριτό μεταβολικό πρότυπο λόγω ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή, που θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω σε συνδυασμό με άλλα ομικά πρότυπα, κυρίως το πρωτεϊνωματικό. Παρατηρήθηκε υψηλότερος ρυθμός του κύκλου Cori, του μονοπατιού των πολυολών και του μεταβολισμού ενός άνθρακα, και χαμηλότερος ρυθμός μεταφοράς λιπαρών οξέων (lipid acid mobilization) στην κατάσταση νηστείας, στην πιο ευαίσθητη σε σύγκριση με την πιο ανθεκτική ομάδα. Εντοπίσαμε μια μεταβολική υπογραφή 19 μεταβολιτών, που εμφανίζει σημαντική διαφορά στη συγκέντρωση μεταξύ των δύο ομάδων, υποστηρίζοντας τη συσχέτιση της ιστοευαισθησίας στα γλυκοκορτικοειδή με την αντίσταση στην ινσουλίνη και τα μονοπάτια που σχετίζονται με το μεταβολικό σύνδρομο. Σε συνδυασμό με τα κλινικά συμπτώματα, θα μπορούσε να εφαρμοστεί ως διαγνωστικό εργαλείο ιστοευαισθησίας υγιών ατόμων στα γλυκοκορτικοειδή. Στη μελέτη μεταβολικής φαινοτύπησης του καρδιακού ιστού μυός σε συνθήκες χημικής επαγωγής υποθυρεοειδισμού με τη χρήση KClO4 στο πόσιμο νερό BALB/cJ μυών, ανακατασκευάστηκε λεπτομερές δίκτυο αντιδράσεων κεντρικού μεταβολισμού άνθρακα καρδιάς μυός με βάση τα μεταβολομικά δεδομένα αυτής και προηγούμενων μελετών του εργαστηρίου σε μοντέλα μυός, ενδελεχή εξέταση της βιβλιογραφίας και βιολογικών βάσεων δεδομένων. Η ερμηνεία των μεταβολομικών αποτελεσμάτων στο πλαίσιο αυτού του μεταβολικού δικτύου κατέδειξε διακριτό μεταβολισμό της καρδιάς μεταξύ των δύο φύλων. Αυτή είναι και η αιτία διαφορετικής αντίδρασής τους στον υποθυρεοειδισμό, που χαρακτηρίζεται από μείωση των επιπέδων γλυκόζης και άλλων μεταβολιτών προερχόμενοι από το αίμα. Στους αρσενικούς μύες, ο μεταβολισμός της καρδιάς βασίζεται κατά κύριο λόγο στην οξείδωση της γλυκόζης και λιγότερο στην οξείδωση των λιπιδίων, σε αντίθεση με τους θηλυκούς. Αυτό πιθανότατα αιτιολογεί γιατί ο μεταβολισμός του καρδιακού ιστού των θηλυκών δεν επηρεάζεται στην αρχή της επαγωγής (δηλ. στις 45 ημέρες χορήγησης KClO4), ενώ στα αρσενικά έχει αρχίσει η επαγωγή του οξειδωτικού στρες και ο καρδιακός ιστός αντιδρά με αύξηση της οξείδωσης των λιπιδίων και αναπλήρωσης του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Στο πιο προχωρημένο στάδιο της φυσιολογίας (δηλ. στις 60 ημέρες χορήγησης), και ο καρδιακός ιστός των θηλυκών βρίσκεται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες, που υποδηλώνεται από την αύξηση της οξείδωσης των λιπιδίων, αναπλήρωσης του TCA κύκλου, του μεταβολισμού ενός άνθρακα και της οξείδωσης της γλυκόζης.Στα αρσενικά, ο καρδιακός ιστός είναι σε πιο προχωρημένο στάδιο οξειδωτικού στρες, αντιδρώντας με την παραγωγή αντιοξειδωτικών μορίων και οξείδωση των γλυκολιπιδίων. Σημειώνεται ότι είναι η πρώτη φορά που καταδεικνύεται αυτή η διαφορά μεταξύ του μεταβολισμού του καρδιακού ιστού ανάμεσα στα δύο φύλα ως η βασική αιτία διαφορετικής απόκρισης στον υποθυρεοειδισμό και σε διαφορετικά στάδια επαγωγής του. Η ανάλυση του μεταβολικού προτύπου εγκεφαλικών περιοχών στις 45 ημέρες χορήγησης παρατηρήθηκε ότι ο αρσενικός μεσεγκέφαλος, ιππόκαμπος και ραβδωτό, αλλά και ο θηλυκός μεσεγκέφαλος και ιππόκαμπος, εμφανίζονται επηρεασμένοι από την διαταραχή συγκριτικά με την ομάδα αναφοράς. Τέλος, οι φυλοειδικές διαφορές καταδεικνύουν την ανάγκη διερεύνησής τους και διακριτής αντιμετώπισης των δύο φύλων ως προς αυτές για την διάγνωση και αντιμετώπιση διαταραχών με κατάλληλα προσαρμοσμένες αγωγές και φάρμακα. Η μελέτη συνέβαλε στην εξέλιξη της γνώσης σχετικά με τα μεταβολικά μονοπάτια ρυθμιστικής αλληλεπίδρασης μεταξύ ιστών, παρέχοντας περισσότερες πληροφορίες για την ανακατασκευή ενός ευρύτερου μεταβολικού μοντέλου που να περιγράφει αξιόπιστα τη μεταβολική φυσιολογία μυός σε επίπεδο οργανισμού, και υπογραμμίζει τη σημασία της συνεκτίμησης των διαφορών φύλου στις έρευνες παθοφυσιολογίας του υποθυρεοειδισμού.
  • Thumbnail Image
    Item
    Embargo
    Ποικιλότητα ειδών, οικοτόπων, οικοσυστημάτων και οικοσυστημικές υπηρεσίες στο Εθνικό Πάρκο Χελμού-Βουραϊκού
    (2022-06-30) Κουμούτσου, Ελένη; Koumoutsou, Eleni
    Η καταγραφή, αξιολόγηση και κατανόηση του φυσικού κεφαλαίου και των παρεχόμενων οικοσυστημικών υπηρεσιών, αποτελεί πρωταρχικής σημασίας στόχο για τη λήψη διαχειριστικών μέτρων και πολιτικών αποφάσεων για την προστασία και ανάδειξη του φυσικού πλούτου και της ανθρώπινης ευημερίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάζεται το φυσικό κεφάλαιο και οι οικοσυστημικές υπηρεσίες στην Προστατευόμενη Περιοχή του Εθνικού Πάρκου και Παγκόσμιου Γεωπάρκου Χελμού-Βουραϊκού της UNESCO (Β. Πελοπόννησος), μέσω της υλοποίησης μελέτης των οικοσυστημικών υπηρεσιών σε τοπική κλίμακα, σύμφωνα με τον Στόχο 2, της Δράσης 5 της Ευρωπαϊκής Στρατηγικής για τη Βιοποικιλότητα. Πιο συγκεκριμένα, με τη χρήση των οδηγιών και της τυπολογίας που προτείνονται για την Ευρωπαϊκή Ένωση, την ανασκόπηση των διαθέσιμων, σχετικών δεδομένων και τις εργασίες πεδίου και τη χρήση της πλατφόρμας MAES_GR, πραγματοποιήθηκαν τα εξής: (α) καταγράφηκαν γεωχωρικά και αναγνωρίστηκαν τα βιοφυσικά χαρακτηριστικά της περιοχής του πάρκου και συγκεκριμένα η χλωριδική ποικιλότητα συνδέθηκε με τη γεωποικιλότητα, την κατάσταση του οικοσυστήματος και τις σχετικές οικοσυστημικές υπηρεσίες, (β) αναγνωρίστηκε γεωχωρικά και περιγράφηκε η κατάσταση των τύπων οικοσυστημάτων, (γ) αναγνωρίστηκαν γεωχωρικά και περιγράφηκαν οι παρεχόμενες, ζητούμενες και δυνητικά παρεχόμενες οικοσυστημικές υπηρεσίες (προμηθευτικές, ρυθμιστικές και διατήρησης, πολιτισμικές), με τη δημιουργία δεικτών αξιολόγησης. Τα κύρια αποτελέσματα αφορούν στη χαρτογράφηση των τύπων οικοσυστημάτων στο Εθνικό Πάρκο Χελμού-Βουραϊκού που αναδεικνύουν την ποικιλομορφία της περιοχής και αναγνωρίζεται η αξία της συνύπαρξης των ανθρωπογενών χρήσεων γης με το καθεστώς προστασίας της περιοχής. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη επιστημονικά τεκμηριωμένων συμπερασμάτων και προτάσεων, υποστηρίζοντας τις τοπικές και εθνικές προσπάθειες για την εφαρμογή της Στρατηγικής για τη Βιοποικιλότητα και καθοδηγώντας τη διαχείριση των χρήσεων γης και τον χωροταξικό σχεδιασμό στην προστατευόμενη περιοχή.
  • Thumbnail Image
    Item
    Open Access
    Study of the endogenous cortical activity : the role of GABAergic and cholinergic neurotransmission in the physiology and pathophysiology of the brain’s neuronal networks
    Kaplanian, Egis Ani; Καπλανιάν, Εγίς Ανί
    Slow oscillations, the hallmark of non-REM sleep, and their cellular counterpart, Up and Down states, are considered a signature of cortical dynamics that reflect the intrinsic network organization. Although previous studies have explored the role of inhibition in regulating Up and Down state activity, little is known about whether this role changes with maturation. This is surprising since both slow oscillations and Up and Down states exhibit significant age-dependent alterations. Furthermore, despite the fact that cholinergic neuromodulation is a crucial regulator of cortical microcircuits’ properties and excitation-inhibition balance, the implication of cholinergic wiring in Up and Down states modulation is poorly studied. To elucidate the developmental impact of GABAb and GABAa receptors on Up and Down state activity, we conducted simultaneous extracellular and intracellular recordings ex vivo, in brain slices of young and adult male mice, using selective blockers, CGP and non-saturating concentration of gabazine, respectively. Blockade of both GABAb- and GABAa- signaling showed age-differentiated functions. CGP caused an increase in Down state duration in young animals, but a decrease in adults. Gabazine evoked Spike-and-Wave-Discharges in both ages; however, while young networks became completely epileptic, adults maintained the ability to generate Up and Down states. Furthermore, voltage clamp recordings of mIPSCs revealed that gabazine selectively blocks phasic currents, particularly involving postsynaptic mechanisms. The latter exhibit clear maturational changes, suggesting a different subunit composition of GABAa receptors between young and adult animals. Indeed, subsequent LFP recordings under diazepam (nanomolar or micromolar concentrations) revealed that mechanisms engaging the drug’s classical-binding-site, mediated by α1-subunit containing GABAa receptors, have a bigger contribution in Up state initiation in young networks compared to adults. In the continuum of our study, we strived to illuminate the role of α5-containing nicotinic acetylcholine receptors (α5* nAChRs) in the generation and maintenance mechanisms of Up and Down states. For this purpose we conducted simultaneous extracellular and intracellular recordings ex vivo in brain slices of young mice from two genotypes (wild type and a5-nACh receptor subunit knockout-ACNA5 Chrna5 or α5-/-) and observed a significant genotype dependent effect on Up and Down state activity: ACNA5 networks turned sluggish with alternating periods of shorter and less frequent Up states and longer Down states compared to wild type. To further elucidate the physiological properties of the ACNA5 microcircuit, we conducted voltage-clamp recordings from layer II/III pyramidal neurons. We showed that these cells receive significantly elevated levels of action-potential dependent inhibitory input which has possibly led to up regulation of synaptic GABAa receptor expression. Subsequent application of CGP and gabazine shed light on an interesting interplay only between α5-nACh receptors and GABAa receptors: blockade of synaptic fast inhibition did not affect ACNA5 networks which kept transiting in physiological Up and Down states, while wild type turned epileptic. Blockade of GABAb receptors had the same effects in the two genotypes, elongation of Up as well as Down states. Taken together, these findings help clarify the mechanisms that underlie the maturation of cortical network activity and enhance our understanding regarding the cortical circuits’ properties in the synchronized slow oscillatory state of the brain.