Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα COUP-TF II στην αγγειογένεση
Loading...
Date
2024-02-21
Authors
Παριανού, Άννα Σοφία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Στους ενήλικους ιστούς, το πλήρως ανεπτυγμένο και λειτουργικό αγγειακό δίκτυο βρίσκεται φυσιολογικά σε ηρεμία και η εκβλάστηση νέων αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα (αγγειογένεση), με εξαίρεση ορισμένες φυσιολογικές λειτουργίες όπως είναι η επούλωση πληγών, περιορίζεται σε παθολογικές καταστάσεις. Ο ρόλος της κατευθυνόμενης από τον όγκο αγγειογένεσης στην ανάπτυξη και μετάσταση συμπαγών όγκων χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά από τον J.Folkman και άνοιξε ένα νέο πεδίο στην αντικαρκινική θεραπεία, με την ανάπτυξη μορίων που στοχεύουν στην διατάραξη της καρκινικής αγγειογένεσης. Εξαιτίας της ταυτοποίησης του παράγοντα VEGF ως βασικού υποκινητή της παθολογικής όπως και της φυσιολογικής αγγειογένεσης, μοριακό στόχο των αντι-αγγειογενετικών φαρμάκων αποτελεί είτε ο ίδιος ο VEGF, είτε ο υποδοχέας του με ενεργότητα τυροσινικής κινάσης, VEGFR2. Δυστυχώς, η κλινική αποτελεσματικότητα των αντι-VEGF φαρμάκων, έχοντας αξιολογηθεί σε βάθος χρόνου, δεν είναι ιδιαίτερα ικανοποιητική. Αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο σε μηχανισμούς αντίστασης του όγκου, με σημαντικότερο εξ΄ αυτών να είναι η αυξορρύθμιση εναλλακτικών μονοπατιών «διάσωσης» της αγγειογένεσης σε απουσία δράσης του VEGF. Ο αγγειογενετικός παράγοντας FGF-2 (bFGF) έχει καλά χαρακτηρισμένο ρόλο στην αποκατάσταση της καρκινικής αγγειογένεσης μετά την έναρξη αντι-VEGF θεραπείας, ενώ μελέτες σε προκλινικά μοντέλα έχουν δείξει πως διπλός αποκλεισμός της VEGF και bFGF σηματοδότησης ξεπερνά αποτελεσματικά τα προβλήματα αντίστασης.
Ο Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor II (COUP-TF II,NR2F2), μέλος της οικογένειας πυρηνικών υποδοχέων στεροειδών/θυρεοειδικών ορμονών αποτελεί καλά συντηρημένο μεταγραφικό παράγοντα με σημαντική έκφραση και ζωτικής σημασίας ρόλο στην εμβρυογένεση. Η έκφρασή του μειώνεται κατά την ανάπτυξη και φτάνει σε σταθερά επίπεδα σε ενήλικους ιστούς. Ένας από τους ιστούς στους οποίους ο COUP-TF II έχει καλά χαρακτηρισμένο ρόλο, είναι το φλεβικό ενδοθήλιο. Η έκφραση του πυρηνικού υποδοχέα σε αυτό καθοδηγεί την εγκαθίδρυση της φλεβικής ταυτότητας και είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό του πρώιμου αγγειακού δικτύου. Στο ώριμο αγγειακό δίκτυο, ο COUP-TF II έχει αναδειχθεί μέσα από in vitro και in vivo μελέτες ως θετικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης, όταν ερέθισμα αυτής αποτελεί ο VEGF-A.
Το μόριο COUP-TF II Inhibitor A 2 (CIA2), ταυτοποιήθηκε πρόσφατα (2020) ως εκλεκτικός αναστολέας της πρωτεΐνης του COUP-TF II και η δράση του στα ενδοθηλιακά κύτταρα μιμείται την αποσιώπηση του COUP-TF II από ειδικό siRNA. Ο CIA2 δεν είναι εμπορικά διαθέσιμος, όμως χάρη στον κύριο Εμμανουήλ Φουστέρη και την ερευνητική ομάδα του Εργαστηρίου Φαρμακευτικής Χημείας του τμήματός μας που τον συνέθεσαν, καταφέραμε να αποκτήσουμε αυτό το χρήσιμο φαρμακολογικό εργαλείο.
Ενώ η ανάγκη της παρουσίας και της φυσιολογικής δράσης του COUP-TF II στην σηματοδότηση VEGF-A/VEGFR2 είναι γνωστή, η πιθανή συμμετοχή του στη διαμεσολαβούμενη από bFGF αγγειογένεση δεν έχει ως τώρα διερευνηθεί. Σκοπό λοιπόν της εργασίας αποτελεί η μελέτη τoυ ρόλου του COUP-TF II σε αγγειογενετικές λειτουργίες ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC in vitro μετά από επίδραση με bFGF και η αποσαφήνιση των πιθανών εμπλεκόμενων μηχανισμών.
Για τον σκοπό αυτό, μελετήθηκε in vitro η επίδραση της αναστολής του COUP-TF II από CIA2 στην επαγόμενη από bFGF επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την ικανότητα σχηματισμού ψευδαγγείων πρωτογενών κυττάρων HUVEC. Σε δεύτερη μοίρα εξετάστηκε η επίδραση τόσο της αποσιώπησης του COUP-TF II από ειδικό siRNA, όσο και της φαρμακολογικής αναστολής του από CIA2 στην ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης κινασών του σηματοδοτικού μονοπατιού που ενεργοποιείται από τον bFGF σε κύτταρα HUVEC, με στόχο τη διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο ο COUP-TF II συμμετέχει στην bFGF/FGFR σηματοδότηση, αλλά και την σύγκριση της δράσης του CIA2 σε σχέση με το ειδικό siRNA.
Η αναστολή του COUP-TF II από CIA2 δεν επηρέασε την βασική επιβίωση κυττάρων HUVEC, όμως ανέστειλε τον επαγόμενη από VEGF-A και bFGF πολλαπλασιασμό τους σε δοκιμασία MTT σε διάστημα 48 ωρών. Ομοίως, σε διαδικασία επούλωσης αμυχής, με bFGF ως ερέθισμα για την κυτταροκίνηση και τον πολλαπλασιασμό των HUVEC, ο CΙΑ2 ανέστειλε το επαγόμενο από bFGF κλείσιμο της αμυχής σε διάστημα 48 ωρών. Σε δοκιμασία χημειοτακτισμού με σύστημα Transwell, διάρκειας 4 ωρών, ο CIA2 ελάττωσε σε μεγάλο βαθμό τη βασική και την επαγόμενη από διαβάθμιση bFGF μετανάστευση των HUVEC χωρίς όμως να έχουμε μείωση της ικανότητας του bFGF να εκκινεί την διαδικασία. Τέλος, η ικανότητα των HUVEC να σχηματίζουν δίκτυο ψευδαγγείων in vitro σε υπόστρωμα Matrigel σε διάστημα 3 ωρών , μια διαδικασία που απαιτεί των συντονισμό πληθώρας λειτουργιών, ανεστάλη από το CIA2 εξίσου αποτελεσματικά στα βασικά επίπεδα, όσο και μετά από επαγωγή με bFGF.
Όσον αφορά στα πειράματα διερεύνησης των εμπλεκομένων μοριακών μηχανισμών που πραγματοποιήθηκαν τόσο με τετράωρη προεπίδραση με CIA2 όσο και με σαρανταοκτάωρη αποσιώπηση του COUP-TF IΙ, εξετάστηκε με ανοσοαποτύπωση Western η ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης των FGFR, αλλά και των καθοδικών MAPK (κινασών ενεργοποιούμενων από μιτογόνα) ERK 1/2 και p38. Και με τις δύο προσεγγίσεις, η επαγόμενη από bFGF ενεργοποίηση της ERK 1/2 μειώθηκε, ενώ αυτή της p38, η οποία έχει ταυτοποιηθεί ως αρνητικός ρυθμιστής της επαγόμενης από bFGF αγγειογένεσης στα HUVEC, αυξήθηκε. Τέλος, τόσο η βασική, όσο και η επαγόμενη από bFGF φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των FGFRs μειώθηκαν και από τις δύο προσεγγίσεις, με τη διαφορά ότι η αποσιώπηση κατάφερε να αναστείλει πλήρως την επαγόμενη από bFGF φωσφορυλίωση των υποδοχέων, ενώ ο CIA2 μόνο μερικώς.
Εν κατακλείδι, η παρούσα εργασία έδειξε ότι εκτός από τις αποκρίσεις στον VEGF, και αυτές στον ισχυρό αγγειογενετικό παράγοντα bFGF τροποποιούνται από καταστολή του COUP-TF II, είτε μέσω αποσιώπησης, είτε μέσω φαρμακολογικής αναστολής. Επομένως, ο μεταγραφικός αυτός παράγοντας, φαίνεται να αποτελεί κομβικό θετικό ρυθμιστή διαδικασιών αγγειογένεσης (πολλαπλασιασμό, κινητοποίηση, κυτταροκίνηση) κατευθυνόμενες και από τον bFGF. Οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν στο αντι-αγγειογενετικό αποτέλεσμα της αποσιώπησης ή της αναστολής του COUP-TF II χρήζουν περαιτέρω εν τω βάθει μελλοντικής διερεύνησης, για να κατανοήσουμε την πιθανή θεραπευτική χρησιμότητα της καταστολής του COUP-TF II.
Description
Keywords
Αγγειογένεση, Ενδοθήλιο, Πυρηνικοί υποδοχείς