Τμήμα Φαρμακευτικής (ΜΔΕ)

Permanent URI for this collection

Browse

Recent Submissions

Now showing 1 - 5 of 504
  • Thumbnail Image
    Item
    Open Access
    Σύνθεση με μεθόδους «πράσινης χημείας» και χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων χαλκού για τοπική εφαρμογή
    (2024-02-29) Χαϊκάλη, Χρυσή; Chaikali, Chrysi
    Πολλά συστατικά φυσικής προέλευσης έχουν χρησιμοποιηθεί κατά τη σύνθεση ανόργανων νανοσωματιδίων προσδίδοντας τους πολλές ενδιαφέρουσες ιδιότητες. Η παρούσα εργασία έχει ως στόχο την παρασκευή και το χαρακτηρισμό ανόργανων νανοσωματιδίων χαλκού με τη χρήση της «Πράσινης Χημείας», δηλαδή με τη χρήση φυτικών εκχυλισμάτων. Η «πράσινη» σύνθεση επιλέχθηκε λόγω των πλεονεκτημάτων που εμφανίζει σε σχέση με τις χημικές μεθόδους. Έχει βρεθεί στη Βιβλιογραφία ότι εκχυλίσματα από μέντα, βασιλικό, γαρίφαλο και ρόδι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή νανοσωματιδίων. Εμείς επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε το χυμό από ρόδι στις συνθέσεις μας. Θα πραγματοποιηθούν μελέτες ως προς τις μεθόδους σύνθεσης NPs και θα γίνει χαρακτηρισμός τους ως προς τη μορφολογία και τις φυσικές τους ιδιότητες. Ο χαρακτηρισμός των ανόργανων νανοσωματιδίων θα επιτευχθεί με τη χρήση τεχνικών όπως οι: DLS, UV/Vis, XRD και TEM. Η επιβεβαίωση του σχηματισμού των NPs θα γίνει με την χρήση φασματοσκοπίας UV/Vis καθώς και από τα αποτελέσματα από το XRD. Το μέγεθος και ζ- δυναμικό τους θα ελεγχθεί με DLS. Με τη χρήση TEM μικροσκοπίας θα γίνει αποκάλυψη της μορφολογίας του κάθε είδους NPs και θα γίνει προσπάθεια αποκάλυψης της κρυσταλλικής τους μορφής με την χρήση των SAED patterns καθώς και XRD. Τέλος, θα πραγματοποιηθούν μελέτες σταθερότητας των νανοσωματιδίων σε διάστημα 90 ημερών με σκοπό να ελεγχθεί η καταλληλόλητά τους για χρήση σε καλλυντικά και φαρμακευτικά σκευάσματα.
  • Thumbnail Image
    Item
    Embargo
    Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα COUP-TF II στην αγγειογένεση
    (2024-02-21) Παριανού, Άννα Σοφία; Parianou, Anna Sofia
    Στους ενήλικους ιστούς, το πλήρως ανεπτυγμένο και λειτουργικό αγγειακό δίκτυο βρίσκεται φυσιολογικά σε ηρεμία και η εκβλάστηση νέων αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα (αγγειογένεση), με εξαίρεση ορισμένες φυσιολογικές λειτουργίες όπως είναι η επούλωση πληγών, περιορίζεται σε παθολογικές καταστάσεις. Ο ρόλος της κατευθυνόμενης από τον όγκο αγγειογένεσης στην ανάπτυξη και μετάσταση συμπαγών όγκων χαρακτηρίστηκε για πρώτη φορά από τον J.Folkman και άνοιξε ένα νέο πεδίο στην αντικαρκινική θεραπεία, με την ανάπτυξη μορίων που στοχεύουν στην διατάραξη της καρκινικής αγγειογένεσης. Εξαιτίας της ταυτοποίησης του παράγοντα VEGF ως βασικού υποκινητή της παθολογικής όπως και της φυσιολογικής αγγειογένεσης, μοριακό στόχο των αντι-αγγειογενετικών φαρμάκων αποτελεί είτε ο ίδιος ο VEGF, είτε ο υποδοχέας του με ενεργότητα τυροσινικής κινάσης, VEGFR2. Δυστυχώς, η κλινική αποτελεσματικότητα των αντι-VEGF φαρμάκων, έχοντας αξιολογηθεί σε βάθος χρόνου, δεν είναι ιδιαίτερα ικανοποιητική. Αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο σε μηχανισμούς αντίστασης του όγκου, με σημαντικότερο εξ΄ αυτών να είναι η αυξορρύθμιση εναλλακτικών μονοπατιών «διάσωσης» της αγγειογένεσης σε απουσία δράσης του VEGF. Ο αγγειογενετικός παράγοντας FGF-2 (bFGF) έχει καλά χαρακτηρισμένο ρόλο στην αποκατάσταση της καρκινικής αγγειογένεσης μετά την έναρξη αντι-VEGF θεραπείας, ενώ μελέτες σε προκλινικά μοντέλα έχουν δείξει πως διπλός αποκλεισμός της VEGF και bFGF σηματοδότησης ξεπερνά αποτελεσματικά τα προβλήματα αντίστασης. Ο Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor II (COUP-TF II,NR2F2), μέλος της οικογένειας πυρηνικών υποδοχέων στεροειδών/θυρεοειδικών ορμονών αποτελεί καλά συντηρημένο μεταγραφικό παράγοντα με σημαντική έκφραση και ζωτικής σημασίας ρόλο στην εμβρυογένεση. Η έκφρασή του μειώνεται κατά την ανάπτυξη και φτάνει σε σταθερά επίπεδα σε ενήλικους ιστούς. Ένας από τους ιστούς στους οποίους ο COUP-TF II έχει καλά χαρακτηρισμένο ρόλο, είναι το φλεβικό ενδοθήλιο. Η έκφραση του πυρηνικού υποδοχέα σε αυτό καθοδηγεί την εγκαθίδρυση της φλεβικής ταυτότητας και είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό του πρώιμου αγγειακού δικτύου. Στο ώριμο αγγειακό δίκτυο, ο COUP-TF II έχει αναδειχθεί μέσα από in vitro και in vivo μελέτες ως θετικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης, όταν ερέθισμα αυτής αποτελεί ο VEGF-A. Το μόριο COUP-TF II Inhibitor A 2 (CIA2), ταυτοποιήθηκε πρόσφατα (2020) ως εκλεκτικός αναστολέας της πρωτεΐνης του COUP-TF II και η δράση του στα ενδοθηλιακά κύτταρα μιμείται την αποσιώπηση του COUP-TF II από ειδικό siRNA. Ο CIA2 δεν είναι εμπορικά διαθέσιμος, όμως χάρη στον κύριο Εμμανουήλ Φουστέρη και την ερευνητική ομάδα του Εργαστηρίου Φαρμακευτικής Χημείας του τμήματός μας που τον συνέθεσαν, καταφέραμε να αποκτήσουμε αυτό το χρήσιμο φαρμακολογικό εργαλείο. Ενώ η ανάγκη της παρουσίας και της φυσιολογικής δράσης του COUP-TF II στην σηματοδότηση VEGF-A/VEGFR2 είναι γνωστή, η πιθανή συμμετοχή του στη διαμεσολαβούμενη από bFGF αγγειογένεση δεν έχει ως τώρα διερευνηθεί. Σκοπό λοιπόν της εργασίας αποτελεί η μελέτη τoυ ρόλου του COUP-TF II σε αγγειογενετικές λειτουργίες ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC in vitro μετά από επίδραση με bFGF και η αποσαφήνιση των πιθανών εμπλεκόμενων μηχανισμών. Για τον σκοπό αυτό, μελετήθηκε in vitro η επίδραση της αναστολής του COUP-TF II από CIA2 στην επαγόμενη από bFGF επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την ικανότητα σχηματισμού ψευδαγγείων πρωτογενών κυττάρων HUVEC. Σε δεύτερη μοίρα εξετάστηκε η επίδραση τόσο της αποσιώπησης του COUP-TF II από ειδικό siRNA, όσο και της φαρμακολογικής αναστολής του από CIA2 στην ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης κινασών του σηματοδοτικού μονοπατιού που ενεργοποιείται από τον bFGF σε κύτταρα HUVEC, με στόχο τη διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο ο COUP-TF II συμμετέχει στην bFGF/FGFR σηματοδότηση, αλλά και την σύγκριση της δράσης του CIA2 σε σχέση με το ειδικό siRNA. Η αναστολή του COUP-TF II από CIA2 δεν επηρέασε την βασική επιβίωση κυττάρων HUVEC, όμως ανέστειλε τον επαγόμενη από VEGF-A και bFGF πολλαπλασιασμό τους σε δοκιμασία MTT σε διάστημα 48 ωρών. Ομοίως, σε διαδικασία επούλωσης αμυχής, με bFGF ως ερέθισμα για την κυτταροκίνηση και τον πολλαπλασιασμό των HUVEC, ο CΙΑ2 ανέστειλε το επαγόμενο από bFGF κλείσιμο της αμυχής σε διάστημα 48 ωρών. Σε δοκιμασία χημειοτακτισμού με σύστημα Transwell, διάρκειας 4 ωρών, ο CIA2 ελάττωσε σε μεγάλο βαθμό τη βασική και την επαγόμενη από διαβάθμιση bFGF μετανάστευση των HUVEC χωρίς όμως να έχουμε μείωση της ικανότητας του bFGF να εκκινεί την διαδικασία. Τέλος, η ικανότητα των HUVEC να σχηματίζουν δίκτυο ψευδαγγείων in vitro σε υπόστρωμα Matrigel σε διάστημα 3 ωρών , μια διαδικασία που απαιτεί των συντονισμό πληθώρας λειτουργιών, ανεστάλη από το CIA2 εξίσου αποτελεσματικά στα βασικά επίπεδα, όσο και μετά από επαγωγή με bFGF. Όσον αφορά στα πειράματα διερεύνησης των εμπλεκομένων μοριακών μηχανισμών που πραγματοποιήθηκαν τόσο με τετράωρη προεπίδραση με CIA2 όσο και με σαρανταοκτάωρη αποσιώπηση του COUP-TF IΙ, εξετάστηκε με ανοσοαποτύπωση Western η ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης των FGFR, αλλά και των καθοδικών MAPK (κινασών ενεργοποιούμενων από μιτογόνα) ERK 1/2 και p38. Και με τις δύο προσεγγίσεις, η επαγόμενη από bFGF ενεργοποίηση της ERK 1/2 μειώθηκε, ενώ αυτή της p38, η οποία έχει ταυτοποιηθεί ως αρνητικός ρυθμιστής της επαγόμενης από bFGF αγγειογένεσης στα HUVEC, αυξήθηκε. Τέλος, τόσο η βασική, όσο και η επαγόμενη από bFGF φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των FGFRs μειώθηκαν και από τις δύο προσεγγίσεις, με τη διαφορά ότι η αποσιώπηση κατάφερε να αναστείλει πλήρως την επαγόμενη από bFGF φωσφορυλίωση των υποδοχέων, ενώ ο CIA2 μόνο μερικώς. Εν κατακλείδι, η παρούσα εργασία έδειξε ότι εκτός από τις αποκρίσεις στον VEGF, και αυτές στον ισχυρό αγγειογενετικό παράγοντα bFGF τροποποιούνται από καταστολή του COUP-TF II, είτε μέσω αποσιώπησης, είτε μέσω φαρμακολογικής αναστολής. Επομένως, ο μεταγραφικός αυτός παράγοντας, φαίνεται να αποτελεί κομβικό θετικό ρυθμιστή διαδικασιών αγγειογένεσης (πολλαπλασιασμό, κινητοποίηση, κυτταροκίνηση) κατευθυνόμενες και από τον bFGF. Οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν στο αντι-αγγειογενετικό αποτέλεσμα της αποσιώπησης ή της αναστολής του COUP-TF II χρήζουν περαιτέρω εν τω βάθει μελλοντικής διερεύνησης, για να κατανοήσουμε την πιθανή θεραπευτική χρησιμότητα της καταστολής του COUP-TF II.
  • Thumbnail Image
    Item
    Embargo
    Νέοι στεροειδείς αποικοδομητές του υποδοχέα των ανδρογόνων
    (2024-02-28) Βεργανελάκης, Αποστόλης; Verganelakis, Apostolis
    Ο καρκίνος του προστάτη (Prostate Cancer, PCa) είναι ο δεύτερος πιο συχνός καρκίνος στους άντρες. Η πλειονότητα των θανάτων από PCa οφείλεται στην ανάπτυξη μεταστατικών μορφών του. Οι υπάρχουσες θεραπείες, όπως η θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (Androgen Deprivation Therapy, ADT) και η χρήση ανταγωνιστών του ανδρογονικού υποδοχέα (Androgen Receptor, AR), όπως η ενζαλουταμίδη και η απαλουταμίδη, έχουν βελτιώσει σημαντικά την ποιότητα ζωής των ασθενών. Παρόλη την αποτελεσματικότητα τους, αναπτύσσονται μηχανισμοί αντίστασης, οι οποίοι προκαλούν την επανεμφάνιση της νόσου. Συνεπώς το ενδιαφέρον εστιάζεται στην ανακάλυψη νέων, καινοτόμων θεραπευτικών παραγόντων για την αντιμετώπιση της νόσου. Στην κατεύθυνση αυτή, αναπτύσσονται χιμαιρικά μόρια στόχευσης πρωτεϊνικής αποικοδόμησης (Proteolysis-Targeting Chimeras, PROTACs) έναντι του AR και μελετώνται σε προκλινικό και κλινικό επίπεδο για τη θεραπεία του PCa. Τα συγκεκριμένα PROTACs αποτελούνται από τρία δομικά τμήματα, έναν προσδέτη του AR, έναν προσδέτη μιας Ε3 λιγάσης και έναν ενδιάμεσο συνδέτη που ενώνει τους δύο αυτούς προσδέτες. Στην παρούσα ερευνητική εργασία, σχεδιάστηκε και διερευνήθηκε η σύνθεση νέων στεροειδών προσδετών του AR, με απώτερο στόχο τη σύνθεση νέων μορίων PROTACs έναντι του AR. Συγκεκριμένα, επιχειρήθηκε η δομική τροποποίηση ενός στεροειδούς παραγώγου το οποίο έχει εμφανίσει ανταγωνιστική δράση έναντι του AR προκειμένου να αξιοποιηθεί ως δομικό τμήμα νέων μορίων PROTACs έναντι του AR. Για τον σκοπό αυτό, μελετήθηκε η σύνθεση νέων παραγώγων με κατάλληλο υποκαταστάτη στη θέση C-7 του στεροειδικού σκελετού. Οι προσπάθειες οδήγησαν στη σύνθεση παραγώγων που έφεραν Ο-αλκυλιωμένη ομάδα αλλυλικής οξίμης στη θέση C-7 του στεροειδούς. Η παρουσία βρωμο-υποκαταστάτη στο άκρο της ανθρακικής αλυσίδας η οποία εισήχθη στο υδροξύλιο της αλλυλική οξίμης επιτρέπει περαιτέρω υποκατάσταση για τη σύζευξη του στεροειδούς προσδέτη με ενδιάμεσους συνδέτες και την τελική συγκρότηση νέων μορίων PROTACs.
  • Thumbnail Image
    Item
    Embargo
    Χαρακτηρισμός δράσεων νέων διεγερτών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε λεία μυϊκά κύτταρα
    (2024-02-23) Στρατουδάκη, Μαρία; Stratoudaki, Maria
    Ένα από τα κεντρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που ελέγχουν την αγγειακή ομοιοστασία είναι ο άξονας του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ). Το ΝΟ, που παράγεται ενδογενώς ή χορηγείται εξωγενώς, δεσμεύεται στον κυτταροπλασματικό υποδοχέα του, τη διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC). H sGC συνιστά ένα ετεροδιμερές ένζυμο, που αποτελείται από α και β υπομονάδες και φέρει μια προσθετική ομάδα αίμης. Η δέσμευση του ΝΟ στην ρυθμιστική υπομονάδα της αυξάνει την καταλυτική ενεργότητα του ενζύμου, με αποτέλεσμα την μετατροπή του GTP στο κυκλικό μονονουκλεοτίδιο, cGMP. Το cGMP κατόπιν δρα ως δεύτερος αγγελιαφόρος που ενεργοποιεί ιοντικά κανάλια, πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφοδιεστεράσες. Η απορρύθμιση του άξονα NO-sGC-cGMP, είτε λόγω ανεπαρκούς παραγωγής ενδογενούς ΝΟ είτε λόγω οξείδωσης της sGC, έχει αποδειχθεί ότι αποτελεί αιτιώδη παράγοντα ανάπτυξης νόσων του καρδιαγγειακού και άλλων συστημάτων, και συνεπώς συνιστά έναν πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο. Τις τελευταίες δεκαετίες, δομικές και φαρμακοχημικές μελέτες επέτρεψαν την ανάπτυξη άμεσων αγωνιστών της sGC, οι οποίοι μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες: μόρια διεγέρτες (sGC stimulators), που δρουν ανεξάρτητα από το ΝΟ αλλά απαιτούν την ύπαρξη ανηγμένης αίμης στην sGC, και μόρια ενεργοποιητές (sGC activators), που δρουν ανεξάρτητα τόσο από το ΝΟ όσο και από την αίμη. Οι αγωνιστές της sGC πλεονεκτούν σε σχέση με ήδη υπάρχοντα φάρμακα που τροποποιούν τον άξονα καθώς μπορούν να δράσουν ακόμα και σε προοξειδωτικές συνθήκες, όπου το παραγόμενο ΝΟ ή η ανταπόκριση της sGC σε αυτό είναι ελαττωματικά, και έχουν ήδη μεταφραστεί σε εγκεκριμένα φάρμακα για την καρδιακή ανεπάρκεια και την πνευμονική υπέρταση. Σκοπός της διπλωματικής εργασίας ήταν ο χαρακτηρισμός ενός νέου αγωνιστή της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης σε λεία μυϊκά κύτταρα. Συγκεκριμένα, ένα υποψήφιο μόριο-διεγέρτης, το KL-67, με έναν καινοτόμο σκελετό πυραζολο-2-πυριδόνης, το οποίο συντέθηκε στο εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας, δοκιμάστηκε in vitro για την αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης του και τη μελέτη των βιολογικών ιδιοτήτων του. Ως πειραματικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκε κυτταρική σειρά αγγειακών λείων μυϊκών κυττάρων από αορτή αρουραίου (Α7r5). Αρχικά, αξιολογήθηκε η ικανότητα της υποψήφιας ένωσης να ενεργοποιεί την sGC, μετρώντας τα επίπεδα του παραγόμενου cGMP με ανοσοδοκιμασία ELISA, με και χωρίς την προσθήκη του δότη ΝΟ, SNP. Βρέθηκε ότι το KL-67 εμφανίζει ασθενή αυτοτελή δράση, ωστόσο επιδεικνύει ισχυρή συνέργεια με το ΝΟ, ενώ η δράση του αναστέλλεται σε συνθήκες οξείδωσης της αίμης, ιδιότητες χαρακτηριστικές της ομάδας των διεγερτών. Η ικανότητά του να αυξάνει τα επίπεδα cGMP επιβεβαιώθηκε από την επαγωγή φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης VASP στη Ser239, μια απόκριση ενδεικτική της ενεργοποίησης του μονοπατιού της PKG, με ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Ακόμη, διερευνήθηκε η ικανότητα της ένωσης να τροποποιεί την απόκριση των ΛΜΚ στο γνωστό μιτογόνο, PDGF-BB, μετρώντας την κυτταρικό πολλπλασισαμό με δοκιμασία ΜΤΤ και την κυτταρική μετανάστευση με δοκιμασίες επούλωσης πληγής και μετανάστευσης διά μέσου μεμβράνης Transwell®. Βρέθηκε ότι το KL-67 μειώνει σημαντικά την επαγωγική δράση του PDGF-BB στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, υποδεικνύοντας ευεργετικό ρόλο στην αγγειακή ομοιοστασία. Επιπλέον, βρέθηκε ότι παράγωγο της σειράς με σκελετό πυραζολο-2-πυριδόνης, το DPK-399, μπορεί να ενεργοποιεί την sGC και σε κύτταρα εκτός του αγγειακού συστήματος, και συγκεκριμένα σε πρωτογενείς ινοβλάστες από πνεύμονα μυός. Εν κατακλείδι, το KL-67, ορθολογικά σχεδιασμένο να δρα ως διεγέρτης της sGC, αποδείχθηκε βιοδραστικό ενώ φαίνεται να επιδεικνύει αγγειοπροστατευτικές ιδιότητες, δοκιμαζόμενο in vitro. Επίσης, η ικανότητα του διεγέρτη DPK-399 να ενεργοποιεί την sGC και σε κύτταρα εκτός του αγγειακού συστήματος, όπως ινοβλάστες, επιτρέπει τη στόχευση επιπλέον θεραπευτικών πεδίων, όπως αυτό της ίνωσης. Έτσι, κρίνεται σκόπιμη η σύνθεση και η δοκιμή επιπλέον παραγωγών της σειράς για την βελτιστοποίηση του νέου σκελετού και την αποσαφήνιση της δράσης του. Αυτό θα επιτρέψει την ανάπτυξη ενός πρότυπου «μορίου-οδηγού» που θα εισαχθεί σε περαιτέρω in vivo μελέτες, ως πιθανό φάρμακο.
  • Thumbnail Image
    Item
    Embargo
    Χαρακτηρισμός νέων αγωνιστών της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης (sGC) σε αγγειακά κύτταρα in vitro
    (2024-02-15) Παίξος, Χαράλαμπος; Paixos, Charalampos
    Το μονοπάτι NO/sGC/cGMP καθορίζει σε σημαντικό βαθμό την ομοιοστασία του καρδιαγγειακού συστήματος αλλά και άλλων ιστών/συστημάτων, όπως το νευρικό και το ήπαρ. Το βασικό ένζυμο αυτού είναι η διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC), μια ετεροδιμερής, κυτοσολική αιμοπρωτεΐνη. Η sGC συγκροτείται από τις υπομονάδες α (ρυθμιστική) και β (καταλυτική) και η επικρατέστερη ισομορφή στο αγγειακό τοίχωμα είναι η α1β1. Στην υπομονάδα β1 βρίσκεται η κοιλότητα H-NOX στην οποία συνδέεται η αίμη που όταν είναι στην ανηγμένη μορφή (συνδεδεμένη με Fe2+) αποτελεί τον υποδοχέα/στόχο του ενδογενούς προσδέτη της sGC, το μονοξείδιο του αζώτου (NO). Η σύνδεση του ΝΟ στην αίμη έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του καρβοξυτελικού άκρου της α1 υπομονάδας του ενζύμου που δρα ως καταλυτική περιοχή και καταλύει την παραγωγή κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης (cGMP) από τριφωσφορική γουανοσίνη (GTP), με αποτέλεσμα είτε ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης εξαρτώμενης από cGMP (PKG), είτε ρύθμιση δράσης φωσφοδιεστερασών (PDEs), είτε έλεγχο λειτουργίας ιοντικών διαύλων εξαρτώμενων από κυκλικά νουκλεοτίδια. Οι βασικές λειτουργίες του άξονα στο αγγειακό περιβάλλον περιλαμβάνουν την αγγειοδιαστολή, την αναστολή της φλεγμονής, την καταστολή της «κινητοποίησης» των λείων μυϊκών κυττάρων και τέλος την αντιθρομβωτική επίδραση. Το εν λόγω κυτταρικό μονοπάτι είναι δυσλειτουργικό σε μια πληθώρα παθοφυσιολογικών καταστάσεων του καρδιαγγειακού όπως την αρτηριακή και την πνευμονική υπέρταση, την αθηροσκλήρωση και την αγγειακή (επανα)στένωση, για παράδειγμα μετά από αθηρεκτομή. Η μειορρύθμιση μπορεί να σχετίζεται με χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ ή/και με οξείδωση του σιδήρου της αίμης από οξειδωτικές ρίζες, που παράγει sGC που δεν αποκρίνεται στο ΝΟ και που οδηγείται, τελικά, σε αποικοδόμηση. Παλαιότερες φαρμακολογικές προσεγγίσεις ενίσχυσης του άξονα (δότες ΝΟ και αναστολείς των PDEs) εμφανίζουν αδυναμίες και περιορισμούς κατά τη χρήση τους, για αυτό οι επιστήμονες στοχεύουν την ενεργοποίηση της κυκλάσης από άμεσους αγωνιστές της sGC (διεγέρτες και ενεργοποιητές της sGC). Οι διεγέρτες δρουν αιμο-εξαρτώμενα, απαιτούν παρουσία Fe2+ στην αίμη και συνεργούν έντονα με το ενδογενές ΝΟ, ενώ οι ενεργοποιητές έχουν αιμο-ανεξάρτητο μηχανισμό, απαιτούν οξείδωση του Fe2+ σε Fe3+ και δρουν αντικαθιστώντας την οξειδωμένη αίμη και σταθεροποιώντας την κυκλάση. Η έκπτωση της δράσης του άξονα αυτού στα αγγεία, συχνά συνδέεται με αυξημένη παρουσία παθοφυσιολογικά σημαντικών αυξητικών παραγόντων (όπως PDGFs) και προφλεγμονωδών κυτταροκινών (όπως TNF-α) που μαζί συνεργούν στην εμφάνιση και την επιδείνωση των αναφερόμενων νόσων. Στόχο της παρούσας διπλωματικής ήταν ο φαρμακολογικός χαρακτηρισμός in vitro γνωστών και νέων sGC αγωνιστών σε αγγειακά κύτταρα. Στο πλαίσιο αυτό, εξετάστηκε ο τρόπος δράσης νέων ενώσεων προερχόμενων από την εταιρεία Bayer® (BAY-543) και από το εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας του Τμήματός μας. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η επήρεια άμεσων αγωνιστών της κυκλάσης σε αποκρίσεις λείων μυϊκών κυττάρων (ΛΜΚ) σε παθοφυσιολογικά αγγειακά ερεθίσματα. Αρχικά, χαρακτηρίστηκε η δράση του BAY-543 σε αγγειακά ΛΜΚ A7r5. Βρήκαμε ότι η ένωση δρα ως αιμοανεξάρτητος «ενεργοποιητής» της κυκλάσης με μερική αγωνιστικότητα σε σχέση με έναν πλήρη αγωνιστή (BAY 58-2667). Όμως, η συγγένεια αυτού έναντι της sGC φαίνεται, μέσω πειραμάτων λειτουργικού συναγωνισμού, να είναι μεγαλύτερη από αυτή του πλήρους. Επιπλέον, η δραστικότητά του BAY-543 απαιτεί οξειδωμένες συνθήκες καθώς δεν είναι αποτελεσματικό παρουσία ανηγμένης αίμης και μάλιστα η δράση του, όταν έχει προηγουμένως οξειδωθεί η αίμη, επηρεάζεται ισχυρότερα απ’ ότι αυτή του ΒΑΥ 60-2770 από το ασκορβικό οξύ, που επιτρέπει την επαναναγωγή της αίμης και μία αμφίδρομη, αντιστρεπτή είσοδο στην κοιλότητα H-NOX. Ακολούθως, αξιολογήσαμε περαιτέρω τις καινοτόμες ενώσεις (DPK-384, DPK-399) με ήδη ταυτοποιημένη βιοδραστικότητα in vitro. Δείξαμε ότι: α) Η ένωση DPK-384 μειώνει την ενεργοποίηση του NFκΒ που επάγεται από TNF-α, μετρώντας την ενεργότητα λουσιφεράσης που εξαρτάται από αυτό το μονοπάτι (NFκΒ dependent luciferase reporter assay) β) η ένωση DPK-399 αναστέλλει την «κινητοποίηση» των λείων μυϊκών κυττάρων A7r5 από PDGFs, μειώνοντας την αύξησή τους (συνδυασμός επιβίωσης και πολλαπλασιασμού μέσω MTT assay) και την κυτταρική μετανάστευση/κυτταροκίνηση (wound scratch assay) επαγόμενες από PDGF-DD. Ανάλογη άμβλυνση παρατηρήθηκε στην κάτωθι σηματοδότηση του PDGFR-ββ, μέσω ελέγχου φωσφορυλίωσης κινασών Erk και Src (Western Blotting). Στο πλαίσιο αξιολόγησης της βιοδραστικότητας των νέων ενώσεων είχαμε αποδείξει πως φωσφορυλιώνουν το κατάλοιπο σερίνης στη θέση 239 της πρωτεΐνης VASP, που είναι ενδεικτικό ενεργοποίησης της PKG. Ωστόσο, δεν είναι απόλυτα σαφές αν το ίδιο κατάλοιπο φωσφορυλιώνεται και από την PKA. Κατά το χαρακτηρισμό του τρόπου δράσης των μορίων, απορρίφθηκε η πιθανότητα δράσης μέσω αύξησης και του cAMP εκτός από αύξηση του cGMP (Luciferase assay, CRE dependent luciferase reporter assay) και, επομένως, η δράση τους σε άλλες πρωτεΐνες στόχους. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι η αύξηση της λειτουργίας του άξονα του NO από άμεσους αγωνιστές της sGC φαίνεται να παρέχει έναν γενικό αγγειοπροστατευτικό ρόλο, μέσω αναστολής των φλεγμονωδών δράσεων του TNF-α και των κυτταροδιεγερτικών δράσεων του PDGF-DD στα ΛΜΚ. Αυτό είναι ιδιαίτερα επιθυμητό σε παθοφυσιολογικές συνθήκες που χαρακτηρίζονται από δυσλειτουργία του άξονα NO/sGC/cGMP λόγω οξειδωτικού στρες και από παθολογική (υπερ)σηματοδότηση από τους παραπάνω παράγοντες, όπως για παράδειγμα στην αθηροσκλήρωση και την επαναστένωση.