Φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί που απομονώθηκαν από τις ακτές του Ιονίου Πελάγους : βιοχημικές μελέτες και βιοτεχνολογικές προοπτικές
Loading...
Date
2024-09-05
Authors
Δρίτσας, Παναγιώτης
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Τα μικροφύκη και τα κυανοβακτήρια είναι μικροοργανισμοί ιδιαίτερης αξίας για τη βασική έρευνα και τη βιοτεχνολογία. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν 12 στελέχη μικροφυκών και 4 στελέχη κυανοβακτηρίων που απομονώθηκαν από τις ακτές του Ιονίου Πελάγους ως προς την ικανότητά τους να αυξάνονται σε διάφορους τύπους βιοαντιδραστήρων και υπό διάφορες συνθήκες καλλιέργειας και να παράγουν μεταβολίτες υψηλής προστιθέμενης αξίας.
Κατόπιν μοριακού χαρακτηρισμού, χρησιμοποιώντας ως δείκτες το γονίδιο του 18S rRNA και την περιοχή ITS τα μικροφύκη τοποθετήθηκαν στα γένη Picochlorum, Tetraselmis, Microchloropsis, Chlorella, Nannochloropsis και Nephroselmis (ποσοστά ομοιότητας 94,8% - 99,9% με χαρακτηρισμένα στελέχη). Για τα κυανοβακτήρια ο δείκτης ήταν το γονίδιο του 16S rRNA και τα στελέχη τοποθετήθηκαν στα γένη Baaleninema, Sodaleptolyngbya και Synechocystis (ποσοστά ομοιότητας 97,2% - 100%). Τα στελέχη των Picochlorum, Nephroselmis, Baaleninema και Sodaleptolyngbya απομονώθηκαν για πρώτη φορά από τα ελληνικά ύδατα.
Τα μικροφύκη καλλιεργούμενα σε φιάλες Erlenmeyer που περιείχαν θρεπτικό υλικό mASW, παρήγαγαν 188,3 - 1558,7 mg L-1 βιομάζας. Τα περισσότερα στελέχη παρήγαγαν λιπίδια σε ικανοποιητικά ποσοστά, προεξέχοντος του P. costavermella VAS2.5 με L/x% = 19,1. Τα στελέχη συνέθεσαν λιπίδια που περιείχαν σε σημαντικά ποσοστά τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs) Δ9,12,15C18:3 (11,9 – 29,8%) ή Δ5,8,11,14,17C20:5 (11,8 – 24,3%). Επίσης, μερικά στελέχη συνέθεσαν Δ9C16:1 σε υψηλά ποσοστά (27,8 – 40,2%). Τα Tetraselmis sp. KAT3.M2, N. pyriformis PAT2.7 και Chlorella sp. AST5.2 παρουσίασαν αξιοσημείωτο περιεχόμενο σε πολυσακχαρίτες, S/x% = 13,4 – 31,5, και όλα τα στελέχη ήταν εξαιρετικοί παραγωγοί πρωτεϊνών, ειδικά το Tetraselmis sp. KAT3.M2 (P/x% = 57,6). Τέλος, το υψηλότερο περιεχόμενο σε χρωστικές καταγράφηκε για τα P. oklahomense (4,7 - 11,3%).
Κύτταρα επιλεγμένων στελεχών από τις ανωτέρω καλλιέργειες ελήφθησαν για παρατήρηση των λιποσωματίων και των χλωροπλαστών τους στα μικροσκόπια φθορισμού και συνεστιακό. Αποδείχθηκε ότι η έκθεση ενός μικροφύκους σε υψηλής έντασης φως κατευθύνει τα σταγονίδια λίπους, μέσω των οποίων μεταφέρονται καροτενοειδή που εξυπηρετούν την φωτο-προστασία, στην περιφέρεια του κυττάρου. Σε αντίθεση με τα Tetraselmis sp. KAT3.M2, Chlorella sp. AST5.2, M. gaditana VON5.3 και M. gaditana AIT5.1, για τα Picochlora, N. pyriformis PAT2.7 και M. gaditana VAT4.3 η παρεχόμενη ένταση φωτός μάλλον ήταν στο εύρος ανοχής τους. Αναφορικά με τη στοιχειακή ανάλυση των μικροφυκών που πραγματοποιήθηκε στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης, βαρύτητα δόθηκε στην εκτίμηση του λόγου O:C που αποτελεί δείκτη καταλληλότητας της βιομάζας ως καύσιμη ύλη. Μόνο το N. pyriformis PAT2.7 που τοποθετήθηκε ενεργειακά στο επίπεδο της τύρφης (O:C = 0,44), η οποία αξιοποιείται για την οικιακή θέρμανση, θα μπορούσε να αποτελέσει καύσιμη ύλη.
Τα P. costavermella VAS2.5, M. gaditana VON5.3, P. oklahomense SAG4.4, N. pyriformis PAT2.7 και P. oklahomense PAT3.2B καλλιεργήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα κλειστού συστήματος (Stirred-Tank Reactor, STR) σε T = 25 οC ή 20 οC σε mASW και σε βιοαντιδραστήρα που προσομοιάζει με ανοιχτή δεξαμενή (Open-Pond Simulating Reactor, OPSR), σε mASW με φωτοπερίοδο 24:0 (φως:σκοτάδι, h) ή παραλλαγές του, με περιορισμό σε άζωτο ή φώσφορο, σε mASW με pH = 7,5 και σε mASW με φωτοπερίοδο 16:8. Τα στελέχη επιλέχθηκαν βάσει των αποδόσεών τους στην παραγωγή βιομάζας και μεταβολιτών υψηλής προστιθέμενης αξίας καλλιεργούμενα σε φιάλες Erlenmeyer, καθώς και λόγω της περιορισμένης βιβλιογραφίας για αυτά.
Οι καλλιέργειες στους 25 oC στον STR απέδωσαν κατά κύριο λόγο υψηλότερη παραγωγή βιομάζας συγκριτικά με τις καλλιέργειες στον OPSR. Τα P. costavermella VAS2.5, M. gaditana VON5.3 και N. pyriformis PAT2.7 αυξήθηκαν και στους 20 oC, εν αντιθέσει με τα P. oklahomense. Το υψηλότερο ποσοστό λιπιδίων καταγράφηκε για τις καλλιέργειες των P. costavermella VAS2.5 (L/x% = 19,3 ± 0,7) και M. gaditana VON5.3 (L/x% = 16,4 ± 1,5) στους 25 oC. Το κυρίαρχο λιπιδιακό κλάσμα ήταν των γλυκολιπιδίων και σφιγγολιπιδίων (G+S) (41,3 – 57,4%) για τα P. costavermella VAS2.5, N. pyriformis PAT2.7 στους 25 oC και M. gaditana VON5.3 στους 20 oC, ενώ των ουδέτερων λιπιδίων (N) (55,6 - 63,5%) στις άλλες καλλιέργειες. Η σύσταση των λιπιδίων και των λιπιδιακών κλασμάτων σε λιπαρά οξέα ήταν γενικά παρόμοια των καλλιεργειών στις φιάλες Erlenmeyer. Το περιεχόμενο των μικροφυκών σε πολυσακχαρίτες ήταν 8,5 – 13,5%. Σχεδόν όλα τα στελέχη ξεχώρισαν για το υψηλό τους περιεχόμενο σε πρωτεΐνες, φτάνοντας μέχρι το P/x% = 50,6 ± 3 στην καλλιέργεια του P. oklahomense PAT3.2B. Το υψηλότερο περιεχόμενο σε χρωστικές καταγράφηκε για το P. oklahomense PAT3.2B, ενώ το χαμηλότερο για το N. pyriformis PAT2.7.
Τα επιλεγμένα στελέχη παρήγαγαν 269,1 – 421,1 mg L-1 βιομάζας καλλιεργούμενα στον OPSR στη συνθήκη ελέγχου. Υψηλότερη παραγωγή βιομάζας καταγράφηκε για τα P. oklahomense SAG4.4 και N. pyriformis PAT2.7 (529,0 ± 52,2 mg L-1 και 452,2 ± 21,0 mg L-1, αντίστοιχα) σε συνθήκες περιορισμού σε φώσφορο. Οι πιο δυσμενείς συνθήκες για την αύξηση των μικροφυκών αποδείχθηκαν ο περιορισμός σε άζωτο, π.χ. 98,0 - 195,7 mg L-1 για τα P. oklahomense, καθώς και η εφαρμογή φωτοπεριόδου 16:8 (154,6 – 220,7 mg L-1). H πλέον αποδοτική συνθήκη για τη συσσώρευση λιπιδίων στα χρησιμοποιούμενα στελέχη αποδείχθηκε η καλλιέργεια σε pH = 7,5, φτάνοντας μέχρι και L/x% = 34,4 ± 4,0 για το P. costavermella VAS2.5. Αντίθετα, οι χαμηλότερες αποδόσεις σημειώθηκαν κυρίως υπό φωτοπερίοδο 16:8. Το κυρίαρχο λιπιδιακό κλάσμα ήταν των G+S, ακολουθούμενο από τα N και P, σε όλες τις συνθήκες καλλιέργειας. Εξαίρεση αποτέλεσε το N. pyriformis PAT2.7 όπου κυριάρχησαν τα N λιπίδια. Η σύσταση λιπιδίων και λιπιδιακών κλασμάτων σε λιπαρά οξέα έδειξε ότι για τα P. costavermella VAS2.5 και M. gaditana VON5.3 που κυριάρχησε το Δ5,8,11,14,17C20:5 αυτό εντοπίστηκε κυρίως στο κλάσμα G (19,3 - 31,4%) ανεξαρτήτως συνθήκης καλλιέργειας, και σε χαμηλότερα ποσοστά στα κλάσματα P (9,4 – 23,3%) και Ν (3,6 – 10%). Εξαίρεση αποτέλεσε η καλλιέργεια του P. costavermella VAS2.5 υπό φωτοπερίοδο 16:8 όπου το Δ5,8,11,14,17C20:5 έφτασε το 36,9 ± 0,3% στο κλάσμα P. Για τα P. oklahomense το Δ9,12,15C18:3 εντοπίστηκε, επίσης, κυρίως στο κλάσμα των G (20,3 – 24,4%) και δευτερευόντως στο P (16,3 – 17,7%) και στο κλάσμα Ν (9,5 – 18,3%). Από την άλλη, στο N. pyriformis PAT2.7 δεν υπάρχει αξιόλογη παραγωγή PUFAs, το πιο ενδιαφέρον λιπαρό οξύ που συντέθηκε ήταν το Δ9C16:1 το οποίο εντοπίστηκε κυρίως στο κλάσμα N (41,1 – 44%), δευτερευόντως στο G (28,8 – 39,4%) και σε μικρότερα ποσοστά στο P (15,2 – 29,6%). Επίσης, αξίζει να αναφερθεί ότι στα λιπίδια του N. pyriformis PAT2.7 εντοπίστηκαν ίχνη Δ6,9,12C18:3 κατά περιπτώσεις. Το περιεχόμενο των εξεταζόμενων μικροφυκών σε πολυσακχαρίτες κυμάνθηκε κατά κανόνα από 10 έως 15%, ανεξαρτήτως των συνθηκών καλλιέργειας. Το περιεχόμενο σε πρωτεΐνες συνήθως ήταν υψηλότερο κατά περιπτώσεις της τάξεως 45-50%, με πιο ευνοϊκές συνθήκες για τη σύνθεσή τους το μέσο ελέγχου, το pH = 7,5 και τον περιορισμό σε φώσφορο. Αντίθετη επίδραση είχε ο περιορισμός σε άζωτο και η φωτοπερίοδος 16:8. Η σύνθεση χρωστικών ήταν κατά κανόνα υψηλότερη στις συνθήκες ελέγχου και σε pH = 7,5.
Τα στελέχη κυανοβακτηρίων καλλιεργήθηκαν σε φιάλες Erlenmeyer σε θρεπτικό υλικό mASW. Στα δύο στελέχη Baaleninema καταγράφηκε υψηλή παραγωγή βιομάζας (x = 801,5 – 939,2 mg L-1), αλλά χαμηλή σύνθεση αποθεματικών λιπιδίων (L/x% = 2,5 – 2,9). Το Synechocystis sp. PAT4.6 παρήγαγε 492,6 mg L-1, με L/x% = 3,2, και το Sodaleptolyngbya sp. VNT5.4, αν και παρήγαγε 362,2 mg L-1 βιομάζας περιείχε περισσότερα λιπίδια (L/x% = 9,1). Τα λιπίδια των στελεχών ήταν πλούσια σε κορεσμένα λιπαρά οξέα. Όσον αφορά στη σύνθεση πολυσακχαριτών και τα δύο στελέχη Baaleninema παρήγαγαν σημαντικές ποσότητες (18,2 - 23,6%), ενώ η σύνθεση αυτών των μορίων ήταν χαμηλότερη στα άλλα δύο στελέχη (9,4 - 10,4%). Από την άλλη πλευρά, έχοντας ως μοναδική εξαίρεση το Sodaleptolyngbya sp. VNT5.4, για όλα τα στελέχη καταγράφηκαν σημαντικά επίπεδα πρωτεϊνών στην κυτταρική μάζα, τα οποία πλησίασαν ή και ξεπέρασαν το 40% επί της ξηρής βιομάζας. Το περιεχόμενο σε χρωστικές ήταν παντού χαμηλό, σε εύρος 0,4 – 1,2%.
Τα P. costavermella VAS2.5, P. oklahomense SAG4.4, M. gaditana VON5.3 και N. pyriformis PAT2.7 καλλιεργήθηκαν και σε βιοαντιδραστήρα ανοικτής δεξαμενής, τύπου Raceway Pond. Τα N. pyriformis PAT2.7 και P. costavermella VAS2.5 παρήγαγαν την περισσότερη βιομάζα (x = 419,1 ± 79,9 mg L-1 και x = 405,7 ± 0,2 mg L-1, αντίστοιχα), ενώ αυτή των P. costavermella VAS2.5 και M. gaditana VON5.3 ήταν πιο πλούσια σε λιπίδια (L/x% = 18,5 ± 1,4 και L/x% = 18,3 ± 2,3, αντίστοιχα). Γενικά, το κυρίαρχο κλάσμα λιπιδίων ήταν των G+S (43,6 - 55,4%), ακολουθούμενο από τα N (27,1 - 50,1%) και P (6,9 - 17,4%). Τα ολικά λιπίδια και τα λιπιδιακά κλάσματα των Picochlora και M. gaditana VON5.3 ήταν πλούσια σε Δ5,8,11,14,17C20:5 και/ή Δ9,12,15C18:3, ενώ το N. pyriformis PAT2.7 συνέθεσε Δ9C16:1 σε υψηλά ποσοστά (30 - 40%). Επιπλέον, όλα τα στελέχη, ιδίως το N. pyriformis PAT2.7, παρουσίασαν υψηλό περιεχόμενο πολυσακχαριτών και πρωτεϊνών. Τα Picochlora και M. gaditana VON5.3 συνέθεσαν χρωστικές ουσίες σε ποσότητες συγκρίσιμες με άλλες μελέτες.
Τα ευρήματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής συμβάλουν στη μελέτη της μικροχλωρίδας των Ελληνικών θαλασσών. Πολλά από τα στελέχη καλλιεργούμενα σε διάφορους τύπους βιοαντιδραστήρα και παραλλαγών των συνθηκών καλλιέργειας, βιοσυνθέτουν ενδιαφέροντα μεταβολικά προϊόντα και επομένως θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε ποικίλες βιοτεχνολογικές εφαρμογές.
Description
Keywords
Μικροφύκη, Κυανοβακτήρια, Μικροβιακά λιπίδια, Πολυσακχαρίτες, Πρωτεΐνες, Χρωστικές, Απομόνωση νέων στελεχών, Ιόνιο Πέλαγος, Μοριακός χαρακτηρισμός, Βιοχημικός χαρακτηρισμός, Φωτοβιοαντιδραστήρες, Βιοντήζελ