Διερεύνηση συνθετικά θνησιγόνων αλληλεπιδράσεων σε κύτταρα με ελαττωματική επιδιόρθωση του DNA και απορρυθμισμένη αδειοδότηση της αντιγραφής
Loading...
Date
2025-09-30
Authors
Λυμπερδοπούλου, Βασιλική-Αστερία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η γονιδιωματική αστάθεια είναι βασικό γνώρισμα του καρκίνου, δεδομένου ότι η-παρουσία της προωθεί σημαντικά την ανάπτυξή του. Πολλά γεγονότα που οδηγούν στην-απώλεια της γονιδιωματικής σταθερότητας μπορούν να εντοπιστούν κατά τη διάρκεια-της S φάσης, όπου το σύνολο του γενετικού υλικού πρέπει να αντιγραφεί με ακρίβεια μια-και μόνο φορά. Μια πολύ σημαντική διαδικασία για τη χωρική και χρονική ρύθμιση της-αντιγραφής είναι η αδειοδότηση της αντιγραφής, η οποία ελέγχεται αυστηρά από μια-πληθώρα παραγόντων. Ένας από αυτούς είναι ο παράγοντας Cdt1, ο οποίος συμβάλλει-στη φόρτωση των MCM2-7 ελικασών στα προ-αντιγραφικά σύμπλοκα και του οποίου η-υπερέκφραση συναντάται σε πολλά είδη καρκίνου. Στα μετάζωα, η πρωτεΐνη Geminin-είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του παράγοντα Cdt1, που κατά τις φάσεις S και G2,-δημιουργεί σύμπλοκα μαζί του και εμποδίζει την επαναπρόσληψή του σε ήδη-πυροδοτημένες θέσεις έναρξης της αντιγραφής. Δεδομένα του εργαστηρίου μας έχουν-αναδείξει τη σημασία της λειτουργίας της πρωτεΐνης για την αποφυγή εμφάνισης-φαινοτύπων γονιδιωματικής αστάθειας καρκινικών κυττάρων. Παράλληλα, έχει φανεί ότι-κύτταρα U2OS υπό σοβαρό αντιγραφικό στρες είναι πιο ευαίσθητα στην απώλεια της-έκφρασης της πρωτεΐνης BRCA2, μιας πρωτεΐνης με κομβικό ρόλο στην προστασία του-γενετικού υλικού. Έτσι, η ταυτόχρονη απώλεια των δύο παραγόντων αξίζει να-διερευνηθεί στο πλαίσιο της συνθετικής θνησιμότητας, ενός καινοτόμου και πολλά-υποσχόμενου πεδίου στον τομέα των αντικαρκινικών θεραπειών.
Στόχος της παρούσας διπλωματικής ήταν η εξερεύνηση της πιθανώς συνθετικά-θνησιγόνου αλληλεπίδρασης μεταξύ Geminin και BRCA2 σε τρεις διαφορετικές-κυτταρικές σειρές. Αυτό πραγματοποιήθηκε κυρίως με τη χρήση RNAi τεχνολογίας-καθώς και με τη διεξαγωγή κλωνογονικών δοκιμασιών και πειραμάτων ανοσοφθορισμού-για την ανίχνευση δεικτών βλάβης του DNA. Αρχικά, σε U2OS κύτταρα επιδιώχθηκε η-τροποποίηση των πειραματικών διαδικασιών προς βέλτιστη ανάδειξη του συνθετικά-θνησιγόνου φαινοτύπου, επιβεβαιώθηκαν ήδη υπάρχοντα αποτελέσματα με τις νέες-πειραματικές συνθήκες και διερευνήθηκε περαιτέρω ο λειτουργικός μηχανισμός πίσω-από αυτή την αλληλεπίδραση. Έπειτα, μελετήθηκε η επίδραση της απώλειας των-πρωτεϊνών BRCA2 και Geminin σε φυσιολογικά κύτταρα hTERT-RPE1 p53-/. Τέλος,-εξερευνήθηκε η επίπτωση απώλειας της έκφρασης της Geminin και σε καρκινικά-κύτταρα Η1299, με δυνατότητα συνεχούς αποσιώπησης του BRCA2 μέσω ενός-[14]-επαγόμενου από δοξυκυκλίνη συστήματος (shBRCA2-DOX). Στα καρκινικά κύτταρα-U2OS, παρατηρήθηκε εξαιρετικά μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα, συνοδευόμενη από-την άνοδο δεικτών γονιδιωματικής αστάθειας στα κύτταρα όπου απουσίαζε η έκφραση-και των δύο πρωτεϊνών. Τα φυσιολογικά κύτταρα, παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερο-πολλαπλασιαστικό δυναμικό στην αντίστοιχη συνθήκη, χωρίς όμως να εμφανίζουν την-αναμενόμενη αυξημένη ανίχνευση μορίων που υποδεικνύουν βλάβες. Όσον αφορά στην-περίπτωση της Η1299 shBRCA2-DOX κυτταρικής σειράς, φάνηκε ότι ο πολλαπλασιασμός-των κυττάρων με ταυτόχρονη απώλεια των BRCA2 και Geminin, περιορίζεται σημαντικά-σε σχέση με τις συνθήκες ελέγχου, χωρίς να υπάρχει σαφής ένδειξη της απουσίας της-γονιδιωματικής σταθερότητάς τους από όλους τους εξεταζόμενους δείκτες βλαβών του-DNA.
Τελικά, η προστατευτική δράση του παράγοντα BRCA2, φαίνεται να είναι-απαραίτητη για την επιβίωση κυττάρων με απορρύθμιση της αδειοδότησης της-αντιγραφής. Ακόμη, όσον αφορά στα U2OS κύτταρα, το έντονο αντιγραφικό στρες-αναδείχθηκε ως ο βασικός πυρήνας της πιθανώς συνθετικά θνησιγόνου αλληλεπίδρασης.
Ταυτόχρονα, στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές απαιτείται εκτενέστερη πειραματική-μελέτη των μηχανισμών που οδηγούν τα κύτταρα με ταυτόχρονη απώλεια των πρωτεϊνών-BRCA2 και Geminin σε θάνατο. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας-αναδεικνύουν την θεραπευτική προοπτική της υπό διερεύνηση συνθετικά θνησιγόνου-αλληλεπίδρασης αλλά και την ανάγκη για περαιτέρω αναζήτηση των μηχανισμών που τη-χαρακτηρίζουν.
Description
Keywords
Αντιγραφή, Γονιδιωματική αστάθεια, Καρκίνος, Αδειοδότηση αντιγραφής, Συνθετική θνησιμότητα, Αντιγραφικό στρες