Κατασκευή φορέων έκφρασης και έκφραση της πλειοτροπίνης και τροποποιημένων μορφών της. Μελέτη της βιολογικής δράσης τμημάτων της πρωτεΐνης
Loading...
Date
2010-04-12T05:44:58Z
Authors
Λάμπρου, Μαργαρίτα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η πλειοτροπίνη είναι αυξητικός παράγοντας 18kDa ο οποίος παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη και εμφανίζει μεγάλη ομολογία με τη midkine, με την οποία σχηματίζουν μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που έχουν υψηλή χημική συγγένεια με την ηπαρίνη. Η πλειοτροπίνη εκφράζεται σε διάφορες μορφές καρκίνου έχοντας είτε επαγωγικό είτε ανασταλτικό ρόλο, με τα διάφορα τμήματα της να εμφανίζουν διακριτές δράσεις σε σχέση με το μητρικό μόριο. Στην παρούσα εργασία υποκλωνοποιήθηκε η κωδική περιοχή της πλειοτροπίνης αλλά και τμημάτων της σε φορείς έκφρασης. Έγινε μετασχηματισμός βακτηρίων με τους φορείς που κατασκευάστηκαν και βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες έκφρασης των πεπτιδίων. Έγινε απομόνωση των τμημάτων που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 9-59 (ΡΤΝ9-59) και 60-110 (ΡΤΝ60-110) με δυο διαφορετικά συστήματα και έγινε αξιολόγηση αυτών των συστημάτων ως προς την απόδοση και την καθαρότητα του προϊόντος. Η καθαρότητα των προϊόντων που προέκυψαν ήταν πολύ καλή, η απόδοση όμως ήταν χαμηλή σε όλες τις περιπτώσεις μικρότερη από 1 mg/ml. Λόγω της χαμηλής απόδοσης, οι ποσότητες των προϊόντων που προέκυψαν δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν σε μελέτες διαμόρφωσης, xρησιμοποιήθηκαν όμως σε βιολογικές μελέτες. Από τη μελέτη των τμημάτων ΡΤΝ9-59 και ΡΤΝ60-110 που απομονώθηκαν, καθώς και ενός συνθετικού πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα της πλειοτροπίνης (ΡΤΝ111-136) προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: 1) Για την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην ανβ3 αλλά και στον RPTPβ/ζ δεν ευθύνονται οι δυο κεντρικές περιοχές της πλειοτροπίνης ΡΤΝ9-59 και ΡΤΝ60-110, 2) το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 έχει την ικανότητα να επάγει τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β3 της ιντεγκρίνης ανβ3 στη θέση Υ773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της κινάσης c-Src, δράση που χάνεται παρουσία ΡΡ1 ή μετά από αποσιώπηση της έκφρασης του RPTPβ/ζ, 3) το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 έχει την ικανότητα να ενεργοποιεί τις ERΚ1/2, επίσης μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της κινάσης c-Src. Το γεγονός ότι το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 ενεργοποιεί μόρια μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται και από την πλειοτροπίνη, ενώ είναι γνωστό ότι αναστέλλει την επαγωγική της δράση στην αγγειογένεση in vivo και την κυτταρική μετανάστευση in vitro, καταδεικνύει ότι οι δράσεις της πλειοτροπίνης περιλαμβάνουν περισσότερους του ενός υποδοχείς ή/και συνυποδοχείς, η λεπτή ρύθμιση των οποίων οδηγεί στην τελική βιολογική της δράση, γεγονός που συνάδει με τις διαφορετικές δράσεις της πλειοτροπίνης που παρατηρούνται σε διαφορετικά συστήματα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την άποψη ότι το C-τελικό άκρο της πλειοτροπίνης παίζει σημαντικό ρόλο στις βιολογικές της δράσεις που σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη, ενώ παραμένει άγνωστος ο ρόλος των κεντρικών της περιοχών.
Description
Keywords
Πλειοτροπίνη, Φορείς έκφρασης