Ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθοδολογιών για NGS αλληλούχηση μεταγράφων της RNA πολυμεράσης III
Loading...
Date
2025-04-30
Authors
Κοτσομήτης, Κωνσταντίνος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Οι περισσότερες εφαρμογές αλληλούχησης επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) επικεντρώνονται κυρίως στα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης II, στα οποία περιλαμβάνονται τα mRNAs και καλά χαρακτηρισμένα μη κωδικά RNAs (ncRNAs). Ωστόσο, πάνω από το 80% των συνολικών κυτταρικών ncRNAs μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση III, όπως τα tRNAs, τα vault RNAs, τα Y RNAs, τα 5S rRNAs και άλλα σημαντικά ρυθμιστικά μη κωδικά RNAs. Αυτά τα μόρια διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο σε θεμελιώδεις κυτταρικές λειτουργίες, όπως η πρωτεϊνοσύνθεση, καθώς και σε διαδικασίες επεξεργασίας και ωρίμανσης RNA μορίων. Η απορρύθμισή τους έχει συσχετιστεί με διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου.
Παρά την αφθονία και τη βιολογική τους σημασία, τα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης III έχουν σε μεγάλο βαθμό αγνοηθεί στις μελέτες NGS. Η δυσκολία στην απομόνωση τους συχνά οδηγεί σε υποεκτίμηση ή ακόμα και πλήρη απώλεια ολόκληρων RNA μορίων, τα οποία έχουν εξαιρετική λειτουργική σημασία. Αυτό αναδεικνύει την ανάγκη για μια εξειδικευμένη μέθοδο απομόνωσης και ανάλυσης του μεταγραφώματος της πολυμεράσης III.
Για να καλυφθεί αυτό το κενό, σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας, η οποία βασιζόταν στην διαδικασία της συν-ανοσοκατακρήμνισης (co-immunoprecipitation, co-IP, που περιλαμβάνει ένα σύμπλοκο από μαγνητικά σφαιρίδια-αντισώματα-ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη La Module, για την απομόνωση και εμπλουτισμό των ncRNAs της RNAP III.
Η La Module πρωτεΐνη αποτελεί τμήμα της πρωτεΐνης La, μιας RBP πρωτεΐνης (RNA Binding Protein). Η La έχει μέγεθος 47 kDa, και ανακαλύφθηκε ως αυτοαντιγόνο σε άτομα τα οποία έπασχαν από Συστηματικό Ερυθηματώδης Λύκο (SLE), καθώς και από το σύνδρομο Sjogren. Έχει καίριο ρόλο στην σταθεροποίηση και στην ωρίμανση των μεταγράφων της RNAP III, ενώ ταυτόχρονα προστατεύει τα μόρια αυτά από εξωνουκλεάσες. Αυτό πραγματοποιείται μέσω πρόσδεσης της La στις UUU 3’ ουρές των RNAP III μεταγράφων. Η πρόσδεση αυτή από την πλευρά της La επιτυγχάνεται μέσω επιμέρους περιοχών στη δομή της. Τέτοιες περιοχές είναι τα μοτίβα La motif, καθώς και το πρώτο RRM μοτίβο (RNA Recognition Motif 1), με τις δύο αυτές περιοχές να συνιστούν το La module. Η σημασία της La στις διαφορετικές λειτουργίες που έχει μέσα στο κύτταρο αποδεικνύονται και από το γεγονός ότι σε πολλούς τύπους καρκίνου, η La φαίνεται να έχει απορυθμιστεί.
Για την ανάπτυξη και την αξιολόγηση της μεθοδολογίας, αρχικά έπρεπε να γίνει παραγωγή και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης από βακτήρια, και στη συνέχεια να ελεγχθεί με Western blot η ικανότητα της πρωτεΐνης να αλληλεπιδρά με το αντίσωμα έναντι της La. Στην συνέχεια, ακολούθησε η In vitro μεταγραφή RNAP III μορίων. Τα μόρια αυτά αξιοποιήθηκαν, μαζί με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, στην δοκιμασία EMSA, με την οποία υπολογίστηκε η ικανότητα πρόσδεσης της La module στα μετάγραφα αυτά. Έπειτα, έγιναν διαφορετικές δοκιμές στο πείραμα συν-ανοσοκατακρήμνισης, με στόχο τον πιο αποτελεσματικό εμπλουτισμό RNAP III μεταγράφων από ένα RNA δείγμα. Κατά την διάρκεια των δοκιμών χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά RNA δείγματα, με σκοπό την αξιοποίηση αυτού που θα έδινε τα βέλτιστα αποτελέσματα. Τέλος, η μέθοδος αξιολογήθηκε με αλληλούχηση επόμενης γενιάς.
Συνοψίζοντας, τα πειράματά μας έδειξαν σημαντικά αποτελέσματα, με σαφή εμπλουτισμό ncRNAs που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση III σε σύγκριση με τα RNAs ελέγχου. Αυτή η προσέγγιση επιτρέπει την αξιόπιστη ταυτοποίηση και χαρακτηρισμό αυτών των ncRNAs, τα οποία συνήθως παραβλέπονται, προσφέροντας νέες γνώσεις για τον ρόλο τους στις κυτταρικές διεργασίες και τις ασθένειες, ενώ παράλληλα μπορεί να αποκαλύψει νέα είδη RNA στο μεταγράφωμα της RNAP III.
Description
Keywords
RNA binding πρωτεΐνη La, Μετάγραφα της RNA πολυμεράσης III, Ανάπτυξη μεθοδολογίας