Δομική μελέτη βιολογικών μακρομορίων για τη δημιουργία φαρμακευτικών στόχων
| datacite.contributor.RelatedPerson | Ελευθερία Ροσμαράκη | |
| datacite.contributor.RelatedPerson | Μαρία Δημαρόγκωνα | |
| datacite.contributor.RelatedPerson | Στέφανος Νταϊλιάνης | |
| datacite.contributor.RelatedPerson | Εμμανουήλ Σαρειδάκης | |
| datacite.contributor.RelatedPerson | Χρήστος Χασάπης | |
| datacite.contributor.RelatedPerson | Νικόλαος Παπαγεωργίου | |
| datacite.contributor.Supervisor | Ειρήνη Μαργιωλάκη | |
| dc.contributor.author | Σπηλιοπούλου, Μαρία | |
| dc.contributor.other | Spiliopoulou, Maria | |
| dc.date.accessioned | 2023-06-13T11:23:37Z | |
| dc.date.available | 2023-06-13T11:23:37Z | |
| dc.date.issued | 2023-05-31 | |
| dc.degree | doctoralThesis | |
| dc.description.abstract | Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη συνδυαστική χρήση βιοχημικών μεθόδων και τεχνικών ακτίνων Χ για το δομικό χαρακτηρισμό βιολογικών μακρομορίων φαρμακευτικού ενδιαφέροντος προς την κατεύθυνση του σχεδιασμού και της ανάπτυξης φαρμακευτικών στόχων. Τα μόρια που μελετήθηκαν παρουσιάζουν ένα εύρος μεγεθών, από πεπτίδια έως πρωτεΐνες. Αναφορικά με τα πεπτίδια, τα συνθετικά ανάλογα ορμονών και η εφαρμογή τους ως πιθανά φάρμακα μελετώνται εκτενώς λόγω της κλινικής τους χρήσης. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκε το οκταπεπτίδιο οκτρεοτίδη (octreotide), που αποτελεί ένα πεπτιδικό ανάλογο της σωματοστατίνης. Παρόλο που το octreotide διατίθεται ήδη στο εμπόριο ως άμορφο εναιώρημα για υποδόρια ή ενδοφλέβια έγχυση, ένα προϊόν σε μικροκρυσταλλική μορφή που παρουσιάζει αυξημένη ενζυμική σταθερότητα και παρατεταμένο χρόνο δράσης θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Προς αυτή την κατεύθυνση, η διερεύνηση των κρυσταλλικών πολυμόρφων του πεπτιδίου από πλευράς ταυτοποίησης και δομικού χαρακτηρισμού είναι εξαιρετικά σημαντική. Τα επιτυχή πειράματα κρυστάλλωσής του ακολούθησε ο πλήρης δομικός του χαρακτηρισμός από δεδομένα περίθλασης ακτίνων Χ από πολυκρυσταλλικά δείγματα (X-ray powder diffraction, XRPD), οδηγώντας σε ένα υψηλής ευκρίνειας (1.87 Å) δομικό μοντέλο (PDB ID: 6vc1), αποκαλύπτοντας τις δομικές ιδιότητες του μορίου το οποίο συμφωνεί στερεογεωμετρικά με τις δομές του octreotide που είχαν προσδιοριστεί σε προηγούμενες μελέτες, ενώ επισημαίνονται κάποιες διαφορές, λόγω της βελτιωμένης ευκρίνειας του χάρτη ηλεκτρονικής πυκνότητας. Επίσης, μελετήθηκε το φαρμακευτικό πεπτίδιο λιραγλουτίδη (liraglutide) που αποτελεί ανάλογο του παρόμοιου με τη γλυκαγόνη πεπτιδίου 1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), χημικά τροποποιημένο με την προσθήκη του παλμιτικού οξέος, το οποίο συνδέεται αντιστρεπτά με την αλβουμίνη του πλάσματος έχοντας παρατεταμένο χρόνο δράσης. Οι in silico μελέτες μοντελοποίησης και τα πειράματα ελέγχου της μεταβολής της θερμοφορητικής κίνησης και του διαφορικού φθορισμού επιβεβαίωσαν την αλληλεπίδραση της αλβουμίνης με το liraglutide. Ωστόσο, η αδυναμία δημιουργίας κρυστάλλων για το σύμπλοκο αυτό, κατευθύνει τις επόμενες μελέτες στη διερεύνηση της διαδικασίας δημιουργίας του συμπλόκου και των συνθηκών κρυστάλλωσης. Σχετικά με τις πρωτεΐνες που εξετάζονται δομικά στη συγκεκριμένη εργασία, πραγματοποιήθηκε εκτενής μελέτη του πολυμορφισμού της ανθρώπινης ινσουλίνης, παρουσία δύο οργανικών μορίων-προσδετών (4-chlororecorcinol, 4-bromorecorcinol) σε ένα εύρος τιμών pH. Η πρόσδεση των μορίων στην ινσουλίνη ταυτοποιήθηκε με πειράματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού διαφορικής μεταφοράς κορεσμού (STD-NMR). Η δομική συμπεριφορά του μορίου καταγράφηκε τόσο μέσω πειραμάτων XRPD, για την ανίχνευση των διαφορετικών πολυμόρφων, όσο και με πειράματα περίθλασης ακτίνων Χ από μονοκρυστάλλους (single crystal X-ray diffraction, SCXRD), για τον ακριβή προσδιορισμό των θέσεων και αλληλεπιδράσεων των προσδετών. Εντοπίσθηκαν τέσσερα πολύμορφα μονοκλινούς συμμετρίας, ένα εκ των οποίων δεν έχει καταγραφεί έως τώρα βιβλιογραφικά για την ανθρώπινη ινσουλίνη, αποδεικνύοντας το πιο πυκνά πακεταρισμένο πολύμορφο για την πρωτεΐνη συγκρυσταλλωμένη με τους δύο αυτούς προσδέτες, κάτι ιδιαίτερα σημαντικό προς την κατεύθυνση της δημιουργίας πολυκρυσταλλικών φαρμάκων. Τα αποτελέσματα δείχνουν την αποτελεσματικότητα μιας νέας προσέγγισης που συνδυάζει τεχνικές φασματοσκοπίας και περίθλασης και παρέχει μια καινοτόμο εναλλακτική λύση για την υψηλής απόδοσης μελέτη της ινσουλίνης. Το επόμενο κεφάλαιο αφορά στη μελέτη πρωτεϊνικών μορίων με κομβικό ρόλο κατά τη διάρκεια ιϊκών κύκλων ζωής, καθώς χαρακτηρίζονται ως κατάλληλοι στόχοι για την ανάπτυξη αντιϊκών φαρμάκων. Οι μελέτες εστίασαν σε δύο οικογένειες ιών, τους Arenaviridae και τους Picornaviridae. Στην πρώτη περίπτωση, περιγράφεται ο μηχανισμός δράσης και πολυμερισμού της νουκλεοπρωτεΐνης, με χρήση βιοπληροφορικών μέσων και δεδομένων ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Επίσης, αναλύεται η παραγωγή, ο έλεγχος σταθερότητας και ενεργότητας και ο δομικός χαρακτηρισμός της περιοχής εξωνουκλεάσης της, απουσία και παρουσία της «βασικής θηλιάς», με απώτερο στόχο τη μελέτη της ποικιλίας των επεκτάσεων των δομικών μοτίβων που εμπλέκονται στον τρόπο πρόσδεσης μεταξύ μορίων νουκλεοπρωτεΐνης και την αξιολόγηση των κύριων λειτουργικών επιπτώσεων των αλληλεπιδράσεων, καθώς και του ρόλου της εξωνουκλεασικής περιοχής, καθιστώντας τη νουκλεοπρωτεΐνη στόχο επιλογής για μελλοντικά εμβόλια και αντιϊκές θεραπείες. Η δεύτερη περίπτωση ιϊκής πρωτεΐνης αφορά στην πρωτεάση 3C του ιού Coxsackie. Συγκεκριμένα, περιγράφεται η πορεία των πειραμάτων έκφρασης, απομόνωσης και κρυστάλλωσης της εν λόγω πρωτεΐνης, ενώ πραγματοποιήθηκε μια εκτενής μελέτη διαλογής δομικών θραυσμάτων, στοχεύοντας στην ανίχνευση αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης με μικρά μόρια. Η εύρεση μορίων που είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με την πρωτεΐνη με τρόπο που να επηρεάζεται η λειτουργία της είναι ένα από τα πρώτα βήματα στο σχεδιασμό ενώσεων που προορίζονται για τη θεραπεία της παθολογίας που προκαλεί ο ιός. Μέσω διαδικασιών βελτιστοποίησης, τα μόρια αυτά μπορούν να αποτελέσουν συστατικό υποψήφιων φαρμάκων για τη θεραπεία αυτής της νόσου. Οι δομικές πληροφορίες που εξάγονται για χημικά μόρια που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό ενώσεων που παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα δράσης έναντι μοριακών στόχων. Το τελευταίο κεφάλαιο σχετίζεται με την ανάπτυξη μεθοδολογιών για τη δομική βιοχημεία, εστιάζοντας στη δομική μελέτη της παγκρεατικής ελαστάσης του χοίρου. Πρόκειται για την αξιοποίηση των πλεονεκτημάτων που προσφέρει η μέθοδος Rietveld για τη βελτιστοποίηση της δομής, εκμεταλλευόμενοι την ανισοτροπική αλλαγή που προκαλούν στο κρυσταλλικό πλέγμα οι μεταβολές θερμοκρασίας. Πολυκρυσταλλικά δείγματα της ελαστάσης μετρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και κρυογονικές θερμοκρασίες και τα δεδομένα περίθλασης αξιοποιήθηκαν με απώτερο στόχο τον πλήρη δομικό χαρακτηρισμό του μορίου. Τα αποτελέσματα δείχνουν την επέκταση των ορίων της μεθόδου XRPD, για τη βελτιστοποίηση δομών μακρομορίων μεγάλου αριθμού αμινοξέων. Για τη συλλογή δεδομένων XRPD χρησιμοποιήθηκε μια ποικιλία εξοπλισμού και οργάνων, ενώ παρουσιάζεται σύγκριση των συλλεχθέντων δεδομένων ανά περιπτώσεις. Ο πρωταρχικός έλεγχος των πολυκρυσταλλικών δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση εργαστηριακών περιθλασιμέτρων και ακολούθησε συλλογή υψηλής ευκρίνειας δεδομένων περίθλασης στον ερευνητικό σταθμό ID22 του Ευρωπαϊκού σύγχροτρον ESRF, ενώ μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και στον ερευνητικό σταθμό MS-X04SA του Ελβετικού σύγχροτρον (SLS), με τη χρήση του καινοτόμου ανιχνευτή MYTHEN II, που ανά περιπτώσεις βελτίωσε δραματικά την ευκρίνεια των δεδομένων περίθλασης. Τέλος, τα πειράματα SCXRD πραγματοποιήθηκαν κυρίως στους ερευνητικούς σταθμούς κρυσταλλογραφίας μακρομορίων (14.1, 14.2 & P13, P14) του σύγχροτρον BESSY II στο Ινστιτούτο Helmholtz του Βερολίνου και του Γερμανικού σύγχροτρον (DESY), αντίστοιχα. Εν κατακλείδι, η συνδυαστική χρήση διαφόρων τεχνικών περίθλασης ακτίνων-Χ για τη συστηματική διερεύνηση της δομικής συμπεριφοράς των μακρομορίων σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών, παρέχοντας κρίσιμες πληροφορίες για τη λειτουργία και τις ιδιότητές τους, είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική, κάτι που αποδεικνύεται από τα ευρήματα και τις παρατηρήσεις της παρούσας διατριβής. | |
| dc.description.sponsorship | Η ερευνητική εργασία υποστηρίχτηκε από το Ελληνικό Ίδρυμα Έρευνας και Καινοτομίας (ΕΛ.ΙΔ.Ε.Κ.) στο πλαίσιο της Δράσης «1η Προκήρυξη ερευνητικών έργων ΕΛ.ΙΔ.Ε.Κ. για την ενίσχυση των μελών ΔΕΠ και Ερευνητών/τριών και την προμήθεια ερευνητικού εξοπλισμού μεγάλης αξίας» (Αριθμός Έργου: 3051). | |
| dc.description.translatedabstract | The present doctoral thesis focuses on the combined use of biochemical methods and X-ray techniques for the structural characterization of biological macromolecules of pharmaceutical interest towards the design and development of drug targets. The molecules under study exhibit a wide range of sizes, from oligopeptides to proteins. Regarding peptides, synthetic hormone analogues and their application as potential drugs are extensively studied due to their clinical use. The present work focuses on octreotide, a peptide analogue of somatostatin. Although octreotide is already commercially available as an amorphous suspension for subcutaneous or intravenous injection, a product in microcrystalline form with increased enzymatic stability and prolonged time of action would be of particular interest. In this direction, the investigation, identification, and structural characterization of crystalline polymorphs of the peptide is of utmost importance. Successful crystallization experiments were followed by its complete structural characterization using X-ray diffraction data of polycrystalline samples (X-ray powder diffraction, XRPD), leading to a high resolution (1.87 Å) structural model (PDB ID: 6vc1). This result revealed structural properties of the molecule which agree stereogeometrically with the octreotide structure identified in previous studies, while highlighting some differences due to the improved resolution of the electron density map. Another pharmaceutical peptide under study is liraglutide, an analogue of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), chemically modified by the addition of palmitic acid, which binds reversibly to human plasma albumin having a prolonged time of action. In silico modeling studies, microscale thermophoresis and differential scanning fluorimetry experiments confirmed the interaction of albumin with liraglutide. However, the inability to generate crystals for this complex provides a direction for subsequent studies towards the investigation of the complex formation process and crystallization conditions. With respect to the proteins that were structurally studied in this work, an extensive study of the human insulin polymorphism in the presence of two organic molecules-ligands (4-chlororecorcinol, 4-bromorecorcinol) in a wide pH range was performed. The binding of these molecules to insulin was identified by saturation transfer difference nuclear magnetic resonance (STD-NMR) experiments. The structural behavior of the molecule was identified via XRPD to detect different polymorphs, while single crystal diffraction measurements (single crystal X-ray diffraction, SCXRD) were also performed to precisely identify the binding sites and interactions of the ligands. Four polymorphs of monoclinic symmetry were identified, one of which has not been reported in the literature for human insulin so far, and it seems to be the most densely packed polymorph for this protein co-crystallized with these two molecules, providing new directions in the development of polycrystalline drugs. The results demonstrate the effectiveness of a novel approach combining spectroscopy and diffraction techniques, providing an innovative alternative for high-throughput insulin studies. The next chapter deals with protein molecules with a key role in virus life cycles, as they are identified as suitable targets for the development of antiviral drugs. The studies focus on two families of viruses, Arenaviridae and Picornaviridae. In the first case, the nucleoprotein mechanism of action and polymerization is described, using bioinformatic tools and electron microscopy data. Furthermore, the production, stability and activity control and structural characterization are analyzed for the exonuclease domain of the nucleoprotein in the presence and absence of the ‘basic loop’, towards the study of the variety of structural motif expansions involved in the binding mechanism between nucleoprotein molecules and the evaluation of the main functional implications of these interactions and the role of the exonuclease domain, making the nucleoprotein a target of choice for future vaccines and antiviral therapy. The second viral protein case involves Coxsackievirus 3C protease. Specifically, the process of expression, purification and crystallization experiments of this protein is described, and an extensive structural fragment screening campaign was performed, aiming to detect interactions of the protein with small molecules. The identification of molecules that interact with the protein is a first step for the design of compounds, which through an optimization process, could act as candidate drugs against the protease for the treatment Coxsackievirus diseases. The structural information extracted for chemical molecules that interact with the protease can be used to design compounds that may exhibit broad activity against molecular targets. The last chapter is related to the development of methodologies for structural biochemistry and focuses on the structural study of porcine pancreatic elastase. It is about exploiting the advantages offered by the Rietveld method for structure refinement by taking advantage of the anisotropic change induced in the crystal lattice by temperature variation. Polycrystalline samples of elastase were measured at room temperature and cryogenic temperatures and the diffraction data were exploited towards the complete structural characterization of the molecule. The results indicate the extension of the molecular size limits of XRPD for structure refinement of macromolecules. XRPD data collection was performed using a variety of equipment and instrumentation, and a comparison of the data collected is presented in some cases. Laboratory measurements were systematically used for the preliminary screening of polycrystalline samples prior to the collection of high-resolution diffraction data at the ID22 beamline of the European Synchrotron (ESRF), while measurements were also performed at the MS-X04SA beamline of the Swiss Light Source (SLS), using the MYTHEN II detector, which in some cases dramatically improved the resolution of the diffraction data. Also, single crystal diffraction measurements were mainly performed at the macromolecular crystallography research stations (14.1, 14.2 & P13, P14) of the BESSY II synchrotron at the Helmholtz Institute in Berlin and the German synchrotron (DESY), respectively. All the results and observations of the PhD thesis underline the effectiveness of the combined use of different X-ray diffraction techniques for the systematic study of the structural behavior of macromolecules under a wide range of conditions, providing essential information on their function and properties. | |
| dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/10889/25066 | |
| dc.language.iso | el | |
| dc.subject | Κρυσταλλογραφία | |
| dc.subject | Δομική βιολογία | |
| dc.subject | Βιοχημεία | |
| dc.subject | Ακτινοβολία σύγχροτρον | |
| dc.subject | Φαρμακευτικά πεπτίδια | |
| dc.subject | Ιικές πρωτεΐνες | |
| dc.subject | Ινσουλίνη | |
| dc.subject | Σχεδιασμός φαρμάκων | |
| dc.subject.alternative | X-ray powder diffraction | |
| dc.subject.alternative | Crystallography | |
| dc.subject.alternative | Structural biology | |
| dc.subject.alternative | Biochemistry | |
| dc.subject.alternative | Synchrotron radiation | |
| dc.subject.alternative | Arenaviruses | |
| dc.subject.alternative | Coxsackievirus | |
| dc.subject.alternative | Human insulin | |
| dc.subject.alternative | Pharmaceutical peptides | |
| dc.subject.alternative | Octreotide | |
| dc.subject.alternative | Liraglutide | |
| dc.subject.alternative | Drug design | |
| dc.title | Δομική μελέτη βιολογικών μακρομορίων για τη δημιουργία φαρμακευτικών στόχων | |
| dc.title.alternative | Structural study of biological macromolecules towards drug target design |