Εμπλουτισμός μη κωδικών μορίων RNA με τη χρήση γενετικά τροποποιημένων συνοδών πρωτεϊνών για εφαρμογές NGS
Loading...
Date
2025-10-02
Authors
Κεφάλας, Γεώργιος Διονύσιος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η τεχνολογία της αλληλούχησης επόμενης γενιάς (NGS) έχει φέρει επανάσταση στη μελέτη του μεταγραφώματος, ωστόσο η πλειονότητα των σχετικών ερευνών επικεντρώνεται στα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης II. Η μελέτη των ncRNAs που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση III παραμένει περιορισμένη, παρά τον μεγάλο μεγάλο ποσοστό των συνολικών κυτταρικών ncRNAs – που ξεπερνά το 80% – και τη λειτουργική σημασία αυτών των μορίων. Σε αυτήν την κατηγορία περιλαμβάνονται σημαντικά μόρια, όπως τα πρόδρομα μεταφορικά RNAs, Vault RNAs, Y RNAs και 5S rRNAs, τα οποία είναι απαραίτητα για τη σωστή λειτουργία του κυττάρου, αφού εμπλέκονται σε βασικές βιολογικές διεργασίες, όπως η πρωτεϊνοσύνθεση, η ωρίμανση μορίων RNA και η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Οι τεχνικές δυσκολίες στην απομόνωσή τους συχνά οδηγούν σε υποεκπροσώπησή τους στα δεδομένα αλληλούχησης. Ανταποκρινόμενη σε αυτό το επιστημονικό και τεχνολογικό κενό, η παρούσα διπλωματική εργασία επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μιας νέας μεθοδολογίας για τον εμπλουτισμό και τη μελέτη των RNAP III μεταγράφων, αξιοποιώντας την πρωτεΐνη La ως εργαλείο επιλεκτικής απομόνωσης.
Η πρωτεΐνη La είναι μια πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με μόρια RNA, η οποία έχει αναγνωριστεί ως αυτοαντιγόνο σε ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο και σύνδρομο Sjogren. Αποτελεί βασικό ρυθμιστικό παράγοντα στη σταθεροποίηση και επεξεργασία των RNA που παράγονται από την Πολυμεράση III. Η πρωτεΐνη La προσδένεται σε UUU-αλληλουχίες στο 3’ άκρο των μεταγράφων, προστατεύοντάς τα από εξωνουκλεάσες και διευκολύνοντας την ωρίμανση και σωστή δομή τους. Αυτή η ικανότητα πρόσδεσης επιτυγχάνεται μέσω δύο βασικών δομικών περιοχών: του La Motif και του RNA Recognition Motif 1 (RRM1), που μαζί συνθέτουν το λεγόμενο La module.
Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε η ανασυνδυασμένη μορφή της πρωτεΐνης La και του La module. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών αυτών σε βακτηριακά κύτταρα, ενώ στη συνέχεια ακολούθησε καθαρισμός και έλεγχος μέσω Ανοσοαποτύπωσης κατά Western της ικανότητας αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών με αντίσωμα έναντι της La. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μεταγραφή in vitro για συγκεκριμένα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης III. Η ικανότητα πρόσδεσης της La και La Module στα συγκεκριμένα μόρια RNA αξιολογήθηκε μέσω της τεχνικής EMSA, επιτρέποντας τη μελέτη της σταθερότητας και της ειδικότητας των δεσμών. Η συγκριτική ανάλυση έδειξε ότι το La Module παρουσίασε αυξημένη συγγένεια πρόσδεσης και μεγαλύτερη εξειδίκευση.
Το κύριο μέρος της εργασίας επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη ενός πρωτοκόλλου συνανοσοκατακρήμνισης (co-IP), με χρήση μαγνητικών σφαιριδίων, στα οποία είχε προσδεθεί αντίσωμα κατά της La, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο σφαιριδίουαντισώματος-πρωτεΐνης. Το σύμπλοκο αυτό στη συνέχεια επωάστηκε με δείγματα RNA, με σκοπό την εκλεκτική απομόνωση και εμπλουτισμό μορίων που προσδένονται ειδικά στο τμήμα της La, La Module.
Αφού πραγματοποιήθηκαν ποικίλες παραλλαγές και βελτιώσεις της μεθοδολογίας για βέλτιστο εμπλουτισμό, η μέθοδος αξιολογήθηκε μέσω NGS. Τα αποτελέσματα έδειξαν επιτυχή εμπλουτισμό των επιθυμητών ncRNAs σε σύγκριση με control δείγματα, επιβεβαιώνοντας την αποτελεσματικότητα της μεθοδολογίας.
Συμπερασματικά, η εν λόγω εργασία ανέπτυξε και εφάρμοσε με επιτυχία μια στοχευμένη μέθοδο απομόνωσης μεταγράφων της RNA πολυμεράσης III, αξιοποιώντας τις μοναδικές ιδιότητες της πρωτεΐνης La. Η προσέγγιση αυτή προσφέρει μια αξιόπιστη λύση σε ένα σημαντικό τεχνολογικό πρόβλημα και παράλληλα ανοίγει νέους δρόμους για την πλήρη κατανόηση του RNAP III μεταγραφώματος και των ρυθμιστικών του ρόλων στην υγεία και τις ασθένειες.
Description
Keywords
RNA πολυμεράση II, Πρωτεΐνη La, Πρωτόκολλο συνανοσοκατακρήμνισης