Επίδραση της αντικατάστασης του συντηρημένου καταλοίπου Arg983 της Ε3 λιγάσης Arkadia στην αλληλεπίδρασή της με το Ε2 ένζυμο UbcH5b και στην αυτο-ουβικιτινίωσή της
Loading...
Date
2025-06-26
Authors
Φραγκάκη, Νεφέλη
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η ουβικιτινίωση είναι μια μετα-μεταφραστική διαδικασία πολύ σημαντική για τη σωστή λειτουργία των περισσότερων οργανισμών, καθώς παίζει κρίσιμο ρόλο στον έλεγχο μιας ευρείας ποικιλίας κυτταρικών μονοπατιών. Το μονοπάτι ουβικιτίνης-πρωτεασώματος είναι ένας από τους βασικότερους τρόπους ώστε συγκεκριμένες πρωτεΐνες-στόχοι, που έχουν επισημανθεί μέσω πρόσδεσης ουβικιτίνης πάνω τους, να οδηγηθούν για αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα 26S. Το μονοπάτι αυτό καταλύεται από τη συνεργασία τριών ενζύμων, το Ε1 ένζυμο ενεργοποίησης της ουβικιτίνης, το Ε2 ένζυμο σύζευξης ουβικιτίνης και μια Ε3 ουβικιτινική λιγάση.
Η ανθρώπινη Arkadia είναι ένα Ε3 ένζυμο που ανήκει στην κατηγορία των Ε3 RING-H2 ουβικιτινικών λιγασών, μιας και περιέχει έναν RING τομέα στο C-τελικό άκρο καθοριστικό για τη δράση της. Αποτελείται από 994 αμινοξικά κατάλοιπα και δρα ως θετικός ρυθμιστής στο TGF-β σηματοδοτικό μονοπάτι αναγνωρίζοντας και οδηγώντας για αποικοδόμηση τα υποστρώματα-αρνητικούς ρυθμιστές i-Smad, c-Ski και SnoN. Πέραν της ουβικιτινίωσης των υποστρωμάτων, η Arkadia διαθέτει την ικανότητα αυτο-ουβικιτινίωσης. Επίσης, ύστερα από μελέτες προσδιορισμού της δομής αλλά και μελέτες αλληλεπίδρασης της RING επικράτειας της Arkadia βρέθηκαν αρκετά κατάλοιπα καλά συντηρημένα που συμμετέχουν στην αλληλεπίδρασή της με το Ε2 ένζυμο UbcH5b. Μάλιστα, σύμφωνα με πολλές μελέτες, οι RING E3 λιγάσες καταλύουν το σχηματισμό μιας κλειστής διαμόρφωσης όταν αλληλεπιδρούν με το σύμπλοκο E2-Ub και συγκεκριμένα προβλέπεται πως ένα συντηρημένο κατάλοιπο, το αλλοστερικό “linchpin” κατάλοιπο, ενισχύει την αλλαγή του διαμορφωτικού ισοζυγίου από μια «ανοιχτή» σε μια «κλειστή» διαμόρφωση.
Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία, μελετήθηκε η επίδραση δύο διαφορετικών μεταλλάξεων του “linchpin” καταλοίπου της Arkadia, την αργινίνη 983 (R983), και πιο συγκεκριμένα στην μετάλλαξη αυτής της αργινίνης σε λυσίνη και σε αλανίνη. Η αργινίνη είναι το πιο σύνηθες και αποτελεσματικό κατάλοιπο σε αυτή τη θέση ανάμεσα στις RING λιγάσες χάρη στην ικανότητά της να σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με την Ub και το Ε2 ένζυμο, καθώς αποτελείται από πολλές ομάδες-δότες δεσμών υδρογόνου. Η λυσίνη είναι ένα άλλο αμινοξύ που απαντάται ως linchpin κατάλοιπο σε κάποιες RING λιγάσες και η πλευρική του αλυσίδα περιέχει αμιδική ομάδα που μπορεί να λειτουργήσει ως δότης δεσμού υδρογόνου, αν και υπάρχουν περιπτώσεις που έχει αποδειχθεί λιγότερο αποτελεσματική από την αργινίνη στην αντίστοιχη θέση. Η αλανίνη είναι ένα υδρόφοβο αμινοξύ, που χρησιμοποιείται ευρέως και στη βιβλιογραφία για μεταλλάξεις, καθώς αποτελείται από μια μικρή αλειφατική πλευρική αλυσίδα που δε δύναται να σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου και συνεπώς στη συγκεκριμένη θέση το πιο πιθανό είναι να αναστείλει ή να περιορίσει την αλληλεπίδραση της Ε3 λιγάσης με το σύζευγμα Ε2-Ub.
Για τη μελέτη της επίδρασης των προαναφερθέντων μεταλλάξεων, έγιναν δομικές μελέτες και μελέτες αλληλεπίδρασης των μεταλλαγμάτων Arg983Lys (R983K) και Arg983Ala (R983A) της Arkadia με το Ε2 ένζυμο UbcH5b μέσω της Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Ακόμα, έγιναν μελέτες της αλληλεπίδρασης αυτών με τη χρήση Θερμιδομετρίας Ισοθερμικής Τιτλοδότησης. Η λειτουργικότητα των μεταλλαγμάτων ως Ε3 ουβικιτινικές λιγάσες ελέγχθηκε μέσω πειραμάτων αυτο-ουβικιτινίωσης, στηριζόμενα στην ιδιότητα της Arkadia για αυτο-ουβικιτινίωση, με τη χρήση της βιοχημικής μεθόδου ανοσοαποτυπώματος κατά Western.
Description
Keywords
Μονοπάτι ουβικιτινίωσης, Linchpin κατάλοιπο