Μελέτη των βιολογικών επιδράσεων της ουσίας Tetraglyme σε υδρόβιους οργανισμούς και σε in vitro πειραματικά μοντέλα
Loading...
Date
2026-04-01
Authors
Χαραλάμπους, Νικολίνα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η Tetraglyme αποτελεί πολικό απρωτικό διαλύτη της κατηγορίας των αιθέρων γλυκόλης και η ευρεία βιομηχανική χρήση της ενισχύει την περιβαλλοντική της παρουσία. Το παραπάνω, σε συνδυασμό με το ανθεκτικό και ιδιαίτερα σταθερό χημικό προφίλ της ουσίας, εγείρει ανησυχίες για τις δυσμενείς επιπτώσεις τόσο στους υδρόβιους οργανισμούς όσο και στην ανθρώπινη υγεία. Η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη έρευνα διερεύνησης των δυνητικών επιπτώσεων της Tetraglyme σε υδρόβιους οργανισμούς και σε in vitro πειραματικά μοντέλα, με απώτερο στόχο την εξαγωγή χρήσιμων δεδομένων και συμπερασμάτων για την επικινδυνότητα της ουσίας και την ορθή διαχείρισή της. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε χημικός χαρακτηρισμός υδατικών διαλυμάτων της ουσίας μέσω των αναλυτικών τεχνικών 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) και UHPLC-MS (Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry), για τον προσδιορισμό της σταθερότητάς της, καθώς και για τη διερεύνηση του σχηματισμού παραπροϊόντων υπό όξινες και αλκαλικές συνθήκες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η Tetraglyme σε αλκαλικές συνθήκες (pH ≥ 7) μπορεί να μετασχηματιστεί, δημιουργώντας παραπροϊόντα, τα οποία ενδέχεται να επηρεάζουν τη βιολογική της δράση. Στη συνέχεια, ακολούθησαν βιολογικές αναλύσεις/δοκιμές, με τη χρήση βιολογικών μοντέλων από διαφορετικά επίπεδα της τροφικής αλυσίδας. Συγκεκριμένα, προσδιορίστηκε η επίδραση της Tetraglyme (δοκιμές 96h) στην ικανότητα ανάπτυξης, στη φωτοσυνθετική απόδοση και στη φωτοσυνθετική λειτουργία (προσδιορισμός φωτοσυνθετικών χρωστικών, όπως χλωροφύλλες και καροτενοειδή) μικροφυκών γλυκού (Scenedesmus rubescens, Chlorococcum sp., Chlorella vulgaris) και αλμυρού (Dunaliella tertiolecta και Tetraselmis suecica) νερού, οι μεταβολές στους δείκτες φθορισμού, καθώς και η ικανότητα εγκλιματισμού τους σε διακυμάνσεις της ακτινοβολίας. Περαιτέρω δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε υδρόβια ασπόνδυλα (Thamnocephalus platyurus, Brachionus calyciflorus, Daphnia magna), με προσδιορισμό του ποσοστού θνησιμότητας και των αντίστοιχων παραμέτρων, καθώς και στο βακτήριο Aliivibrio fischeri, με προσδιορισμό της αναστολής της βιοφωταύγειας (χρήση του συστήματος Microtox). Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στην εκτίμηση των επιπτώσεων της υπό μελέτη ουσίας στο δίθυρο μαλάκιο Mytilus galloprovincialis, τόσο σε επίπεδο οργανισμού (in vivo) όσο και σε απομονωμένα αιμοκύτταρα (in vitro). Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η ικανότητα της Tetraglyme να επάγει κυτταροτοξικές επιπτώσεις (τεχνική Neutral Red Retention Time), οξειδωτική καταπόνηση (επίπεδα O2•−, NO, MDA και ROS) και γενοτοξικές βλάβες (συχνότητα εμφάνισης μικροπυρήνων/MN) σε ιστούς του είδους (αιμόλεμφος/αιμοκύτταρα), ενώ πραγματοποιήθηκε μεταγραφωματική ανάλυση στα βράγχια των εκτιθέμενων ατόμων, προκειμένου να ανιχνευθούν πιθανές διαφοροποιήσεις στην έκφραση γονιδίων και να κατανοηθούν τυχόν μοριακές διεργασίες που ενεργοποιούνται μετά την έκθεση στην Tetraglyme. Ακόμη, αξιολογήθηκε η κυτταρο-γενοτοξική και οξειδωτική δράση της Tetraglyme και/ή των παραγώγων της σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων, μέσω της μεθόδου προσδιορισμού μικροπυρήνων με αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis-block Micronucleus/CBMN assay), με και χωρίς την προσθήκη εξωγενούς μεταβολικού συστήματος (S9 mix), και προσδιορίστηκε η παραγωγή ενδοκυτταρικών δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species/ROS) μέσω της τεχνικής DCFH-DA. Τέλος, διερευνήθηκε, μέσω υπολογιστικών προσομοιώσεων και κρυσταλλογραφικών πειραμάτων, η πιθανότητα πρόσδεσης της Tetraglyme με την πρωτεΐνη λυσοζύμη (Hen Egg White Lysozyme/HEWL), ώστε να διαπιστωθεί αν η υπό μελέτη ουσία είναι ικανή να προκαλέσει αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωσή της. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η Tetraglyme (και πιθανώς τα παραπροϊόντα της), αν και θεωρείται ουσία χαμηλής επικινδυνότητας, μπορεί να προκαλέσει ήπιες βιολογικές επιδράσεις σε ευρύ φάσμα οργανισμών και βιολογικών μοντέλων, οι οποίες εκδηλώνονται σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από μg έως mg L-1. Στην περίπτωση των μικροφυκών, η Tetraglyme μπορεί να προκαλέσει αναστολή της ανάπτυξης, καθώς και μικρού έως μέτριου βαθμού μεταβολές στη φωτοσυνθετική συσκευή τους, τόσο σε επίπεδο απόδοσης του φωτοσυστήματος ΙΙ (PSII) όσο και στην ικανότητα εγκλιματισμού σε διαφορετικές συνθήκες έντασης φωτός, αναδεικνύοντας την ενεργοποίηση φωτοπροστατευτικών μηχανισμών ως απόκριση στην περιβαλλοντική καταπόνηση. Η διαφοροποιημένη απόκριση (ευαισθησία) μεταξύ των μικροφυκών, παρατηρήθηκε και στα ζωοπλαγκτικά είδη που εξετάστηκαν (υδρόβια ασπόνδυλα) και στο βακτήριο Aliivibrio fischeri. Συγκεκριμένα, η Tetraglyme φαίνεται να επηρεάζει σε μεγαλύτερο βαθμό το είδος B. calyciflorus, ενώ το είδος D. magna εμφανίζει την μεγαλύτερη ανθεκτικότητα. Στο βακτήριο A. fischeri παρατηρήθηκε αναστολή της βιοφωταύγειας, γεγονός που οδήγησε στον χαρακτηρισμό της ουσίας ως επιβλαβούς, βάσει των τιμών EC50, υποδηλώνοντας πιθανή διαταραχή στον μεταβολισμό του είδους, κυρίως σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, ενώ παράλληλα καταδεικνύεται ότι η Tetraglyme εμφανίζει χαμηλή τοξικότητα σε μικροοργανισμούς, χωρίς όμως να είναι πλήρως βιολογικά αδρανής. Επιπρόσθετα, η παρούσα έρευνα αποκάλυψε για πρώτη φορά ότι η Tetraglyme, ακόμη και σε περιβαλλοντικά ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις, μπορεί να προκαλέσει σημαντικές κυτταρικές, οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις στο είδος Mytilus galloprovincialis, όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα O2•−, NO, MDA και ROS, την αποσταθεροποίηση των λυσοσωμικών μεμβρανών και την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης μικροπυρήνων στα αιμοκύτταρα των εκτιθέμενων ατόμων, ενώ ο σημαντικός αριθμός διαφοροποιημένων εκφραζόμενων γονιδίων (Differentially Expressed Genes/DEGs) στα βράγχια αποκάλυψε εκτεταμένες μοριακές διαταραχές και επιδράσεις σε μονοπάτια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό της Tetraglyme, τη σηματοδότηση, την απόπτωση, τη λυσοσωμική λειτουργία και την ομοιόσταση των κυττάρων. Στην περίπτωση των ανθρώπινων λεμφοκυττάρων, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Tetraglyme ή/και τα παράγωγά της δεν είναι κυτταροτοξικά, όσον αφορά την πρόκληση κυτταρικής θνησιμότητας, αλλά είναι ικανά να επάγουν ήπιο οξειδωτικό stress (παραγωγή ROS) και κυτταρο-γενοτοξικές επιπτώσεις, κυρίως στην περίπτωση προσθήκης εξωγενούς μεταβολικού συστήματος. Τέλος, οι υπολογιστικές προσομοιώσεις (molecular docking και molecular dynamics) έδειξαν πιθανά σημεία πρόσδεσης της Tetraglyme στην HEWL, καθώς και ενδεχόμενες δομικές επιδράσεις, χωρίς να επιβεβαιώνεται η πρόσδεση της ουσίας στην πρωτεϊνη, μέσω των XRPD, SCXRD και SSX κρυσταλλογραφικών δεδομένων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας αμφισβητούν τον μέχρι σήμερα χαρακτηρισμό της Tetraglyme ως περιβαλλοντικά φιλικής ουσίας, ένας χαρακτηρισμός που βασίστηκε κυρίως στη χαμηλή πτητικότητα και στη μειωμένη οξεία τοξικότητά της σε σύγκριση με άλλους οργανικούς διαλύτες. Τα ευρήματά μας αναδεικνύουν ότι η Tetraglyme είναι ικανή να επάγει στοχευμένες κυτταρικές και μοριακές αποκρίσεις, τονίζοντας την ανάγκη επαναξιολόγησης του περιβαλλοντικού κινδύνου που ενδέχεται να παρουσιάζει, με απώτερο στόχο την καλύτερη και ορθολογική χρήση/διαχείρισή της, καθώς και την πρόληψη και αποφυγή επιπτώσεων τόσο για το περιβάλλον όσο και για την ανθρώπινη υγεία.
Description
Keywords
Τοξικολογία, Υδρόβιοι οργανισμοί, Γενοτοξικότητα, Κυτταροτοξικότητα, Οξειδωτικό στρες, In vitro πειραματικά μοντέλα, Κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, Βιολογικές επιδράσεις, Αναδυόμενοι ρύποι, Μεταγραφωματική ανάλυση