CRISPR διαμεσολαβούμενη απαλοιφή των γονιδίων RPP38 και RPP40 της ανθρώπινης RNase P και μελέτη του ρόλου τους
Loading...
Date
2023-05-05
Authors
Παχή, Μαρία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η ριβονουκλεάση P (RNase P) είναι ένα σημαντικό ριβοένζυμο που συναντάται σε οργανισμούς και από τα τρία Βασίλεια της ζωής (Βακτήρια, Αρχαία, Ευκαρυώτες). Χαρακτηρίζεται ως ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (RNP) καθώς αποτελείται από ένα καταλυτικό RNA και από μεταβλητό αριθμό πρωτεϊνών, από μία στα Βακτήρια, έως πέντε στα Αρχαία και μέχρι δέκα στα Ευκάρυα. Κύριος λειτουργικός της ρόλος είναι η αφαίρεση της 5΄οδηγού-αλληλουχίας (5΄ leader) των πρόδρομων μορίων tRNA (pre-tRNA) κατά την διαδικασία της ωρίμανσής τους. Ωστόσο, η RNase P μπορεί να δράσει και σε πρόσθετα υποστρώματα, όπως είναι το 4.5S RNA από το οργανισμό Ε. coli ή ακόμα και σε μη κωδικά μόρια RNA (long non-coding RNAs) όπως το MALAT1. Η ανθρώπινη RNase P, απαρτίζεται από μία RNA υπομονάδα, την RPPH1 και από τις ακόλουθες πρωτεϊνικές υπομονάδες RPP14, RPP20, RPP21, RPP25, RPP29, RPP30, RPP38, RPP40, POP5 και POP1. Έχει ανακαλυφθεί πως οι υπομονάδες αυτές πέραν της συνεισφοράς τους στη συγκρότηση του ολοενζύμου, συμμετέχουν σε επιπρόσθετες κυτταρικές λειτουργίες όπως η συμμετοχή τους στη μεταγραφή και την επιδιόρθωση βλαβών του γενετικού υλικού, κ.ά.
Στην παρούσα μελέτη, διερευνάται ο βιολογικός ρόλος των πρωτεϊνικών υπομονάδων RPP38 και RPP40 στα καρκινικά κύτταρα τραχήλου μήτρας (HeLa), μέσω της χρήσης εργαλείου γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR/Cas9. Σε πρώτο στάδιο, σχεδιάστηκαν αλληλουχίες-οδηγοί που στοχεύουν τα γονίδια των RPP38 και RPP40 και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακό φορέα pX459, ο οποίος εκφράζει πέρα από το sgRNA και την Cas9 νουκλεάση. Ακολούθησε διαμόλυνση κυττάρων HeLa και η δημιουργία των τροποποιημένων κυτταρικών σειρών HeLa mutant RPP38 και HeLa mutant RPP40 για τις οποίες πιστοποιήθηκε η φύση της μετάλλαξης μέσω αλληλούχησης της θέσης στόχου. Οι συγκεκριμένες τροποποιήσεις δεν επηρέασαν την βιωσιμότητα των κυττάρων, ωστόσο παρατηρήθηκε μια μικρή μείωση στο ρυθμό πολλαπλασιασμού για τις δυο τροποποιημένες κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια, με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής (FACS) διαπιστώθηκε ότι μόνο στην περίπτωση της πρωτεϊνικής υπομονάδας RPP40 παρουσιάστηκε συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου. Αντιθέτως, στην περίπτωση της RPP38 η κατανομή των κυττάρων στις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου δεν επηρεάστηκε. Επιπλέον, μελετήθηκε η διαφορική έκφραση σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων και παραγόντων έναρξης της μετάφρασης στους τροποποιημένους κλώνους μέσω RT-qPCR. Παράλληλα, αποδείχθηκε μειωμένη δραστικότητα της RNase P, in vitro, μετά από τις τροποποιήσεις της RPP38 υπομονάδας. Τέλος, στην προσπάθεια να διευκρινιστούν οι επιδράσεις των τροποποιήσεων στην mTOR-διαμεσολαβούμενη μετάφραση των κυττάρων, πραγματοποιήθηκαν ανοσοαποτυπώσεις κατά Western για διάφορους παράγοντες που συμμετέχουν στο σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K/AKT/mTOR. Συμπερασματικά, αποδείχθηκε μείωση του μεταφραστικού ρυθμού με χρήση πουρομυκίνης και για τις δύο κυτταρικές σειρές.
Description
Keywords
Ριβονουκλεάση P, Γονιδιωματική επεξεργασία, Μεταφορικό RNA, Έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης, mTOR-διαμεσολαβούμενη μετάφραση