Novel transgenic models for the delineation of mechanisms regulating proteolysis and inflammation in skin diseases
| datacite.contributor.RelatedPerson | Ζουμπουρλής, Βασίλειος | |
| datacite.contributor.RelatedPerson | Πατρινός, Γεώργιος | |
| datacite.contributor.Supervisor | Σωτηροπούλου, Γεωργία | |
| datacite.rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 | el |
| dc.contributor.author | Χάρλα, Ελένη | |
| dc.contributor.other | Charla, Eleni | |
| dc.creator.orcid | 0000-0001-8511-3191 | |
| dc.date.accessioned | 2021-12-17T06:33:30Z | |
| dc.date.available | 2021-12-17T06:33:30Z | |
| dc.date.copyright | 2021-12-16 | |
| dc.degree | masterThesis | el |
| dc.description.abstract | PART I: Netherton syndrome (NS) and peeling skin disease (PSD) are genetic rare skin disorders sharing clinical characteristics including allergies, epidermal overdesquamation, and skin inflammation. Kallikrein-related peptidases (KLKs), which are proteolytic enzymes, were reported to be hyperactivated both in NS and PSD skin. Specifically, published studies have proposed that hyperactivity of KLK5 and KLK7 are the main contributors of epidermal overdesquamation observed in NS (Furio et al., 2015; Kasparek et al., 2017; Bisyris et al., 2021a and 2021b; Zingkou et al., 2021). Furthermore, elevated expression, as well as activity of KLK5, were reported in PSD (Oji et al., 2010; Komatsu et al., 2006). In terms of this thesis, Part I will investigate the role of KLK6 in NS, while the role of KLK5 in PSD will be assessed in Part II. NS is a severe rare disease caused by inherited homozygous mutations in Spink5, encoding the endogenous serine protease inhibitor LEKTI. NS is characterized by atopic manifestations, allergies, inflammation, and potentially lethal skin overdesquamation and inflammation associated with highly elevated epidermal proteolysis. The role of KLK6 in NS pathology remains unknown. A skin biopsy obtained from a patient with NS was analyzed and KLK6 expression was found increased along with increased nuclear localization of the NF-κB transcription factor when compared to normal specimens obtained from three healthy donors. This thesis addresses the hypothesis whether deletion of Klk6 in Spink5 null-epidermis could suppress overdesquamation and/or inflammation associated with NS. To experimentally test this hypothesis, we bred the double knockout (DKO) mouse model Spink5-/-Klk6-/- by crossing Klk6-/- mice with heterozygous Spink5+/– mice that display a rather normal phenotype, since Spink5-/- mice die homogeneously within 4-5 hours from birth (Zingkou et al., 2019). We found that deletion of Klk6 in Lekti-deficient epidermis could not reverse the neonatal lethal NS phenotype (Zingkou et al., 2019). Extensive detachment of the stratum corneum, and impaired skin barrier function was observed in Spink5-/-Klk6-/- mice by eosin/hematoxylin staining and toluidine blue dye penetration assay, respectively. Gel zymography and in situ zymography showed that overall proteolytic activities in the epidermis of Spink5-/-Klk6-/- mice were elevated similarly to Spink5-/-. In contrast, Spink5-/-Klk6-/- mice displayed normalized keratinocyte differentiation, confirmed by IHC staining, and normalized expression of (coreno)desmosomal proteins including keratin 5, involucrin, loricrin, desmoglein-1, desmocollin-1 and corneodesmosin (Zingkou et al., 2019). In addition, ablation of Klk6 suppressed abnormal keratinocyte proliferation associated with NS since Ki67 expression was significantly reduced in the epidermis of DKO mice. This could be correlated with suppressed relative expression of Tslp and other inflammatory cytokines such as Tnf-α, Il-1β, Il-6, Il-17α, Il-23, Il-13 and Il-4 in DKO skin, as well as reduced numbers of infiltrating mast cells in the dermis. Par-2 expression, nuclear localization of NF-κB and Erk1/2 phosphorylation was reduced in DKO compared to Spink5-/- mice, indicative of suppressed activation of the Erk1/2-NF-κB signaling. Klk6 deletion could suppress skin inflammation via the KLK6-ERK1/2-NF-kB-TSLP axis. Cumulatively, elimination of Klk6 in the Lekti-deficient epidermis was not sufficient to ameliorate overdesquamation, a consequence of aberrantly elevated proteolysis, and did not restore the defective skin barrier leading to neonatal lethality. Nevertheless, ablation of Klk6 resulted in remarkable repression of epidermal inflammation, indicated by reduced Tslp expression via repression of the Erk1/2-NF-κB pathway. In addition, epidermal differentiation was normalized (Zingkou et al., 2019). Most importantly, our findings demonstrate for the first time that KLK6 is implicated in skin inflammation and may represent a novel druggable target for NS and other more common skin inflammatory diseases, such as atopic dermatitis. PART II: Homozygous mutations in CDSN gene, encoding corneodesmosin, cause type B peeling skin disease, an autosomal recessive skin disorder with ichthyosiform erythroderma and exfoliation (Bowden, 2011). Cdsn-/- mice recapitulate PSD clinical symptoms showing aberrant overdesquamation, which leads to neonatal lethality due to severe dehydration (Leclerc et al., 2009). Since KLK5 hyperactivation has been reported in severe ichthyoses such as the PSD, we hypothesized that elimination of Klk5 could reverse the cutaneous hallmarks of PSD. Thus, we bred Cdsn-/-Klk5-/- mice previously generated (Sotiropoulou et al., personal communication) by crossing Klk5-/- mice with heterozygous Cdsn+/– mice that display a normal phenotype, since Cdsn-/- mice die homogeneously 30 min after birth. Macroscopic and histological examination of newborn Cdsn-/-Klk5-/- mice and isolated skin biopsies, showed that ablation of Klk5 in the Cdsn-null background does not reverse the lethal phenotype of PSD and could not restore a normal structure of the epidermis. Toluidine blue dye penetration assay revealed that deletion of Klk5 could not restore skin barrier function, since Cdsn-/-Klk5-/- pups stained blue, indicative of extensive skin barrier disruption. Gel and in situ zymography showed that elevated proteolysis was not suppressed in the epidermis. In conclusion, targeted deletion of Klk5 alone was not sufficient to reduce aberrantly elevated proteolytic activities and associated overdesquamation in the epidermis of Cdsn-/-. Consequently, the defective skin barrier and associated neonatal lethality could not be rescued. Nonetheless, ablation of Klk5 in the Cdsn-null background restored normal epidermal differentiation. Integrated transcriptomics and degradomics analyses are ongoing to identify alternative proteases that are active in PSD epidermis. | el |
| dc.description.translatedabstract | ΜΕΡΟΣ Ι: Το σύνδρομο Netherton (NS) και η νόσος PSD (PSD, peeling skin disease) είναι σπάνιες γενετικές ασθένειες με κοινά κλινικά χαρακτηριστικά, όπως αλλεργίες, υπεραποφολίδωση και φλεγμονή του δέρματος. Οι ανθρώπινες καλλικρεΐνες (KLKs, kallikrein-related peptidases) είναι υπερ-ενεργοποιημένες τόσο στην επιδερμίδα ασθενών με σύνδρομο Netherton, αλλά και ασθενών με νόσο PSD. Συγκεκριμένα, δημοσιευμένες μελέτες έδειξαν ότι η υπερδραστηριότητα των σερινο-πρωτεασών KLK5 και KLK7 προκαλεί την επιδερμική υπεραποφολίδωση που παρατηρείται στο σύνδρομο Netherton (Furio et al., 2015; Kasparek et al., 2017; Bisyris et al., 2021a and 2021b; Zingkou et al. 2021). Επιπλέον, η έκφραση καθώς και η ενεργότητα της KLK5 έχει αναφερθεί ότι είναι αυξημένη στο PSD (Oji et al., 2010; Komatsu et al., 2006). Στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης, θα αξιολογηθεί ο ρόλος της KLK6 στο σύνδρομο Netherton (Μέρος Ι), καθώς και ο ρόλος της KLK5 στην νόσο PSD (Μέρος ΙΙ). Το σύνδρομο Netherton αποτελεί μια σπάνια, αλλά σοβαρή ασθένεια που προκαλείται από κληρονομικές ομόζυγες μεταλλάξεις στο Spink5, γονίδιο που κωδικοποιεί τον ενδογενή αναστολέα πρωτεασών σερίνης LEKTI. Χαρακτηρίζεται από ατοπικές εκδηλώσεις, αλλεργίες, φλεγμονή και δυνητικά θανατηφόρο υπεραποφολίδωση του δέρματος που προκαλείται από την έκτοπη ενεργοποίηση πρωτεασών στην επιδερμίδα, λόγω της ανεπάρκειας LEKTI. Ο ρόλος της KLK6 στο σύνδρομο Netherton δεν έχει διερευνηθεί. Μια βιοψία δέρματος που αποκτήθηκε από έναν ασθενή με σύνδρομο Netherton αναλύθηκε και η έκφραση KLK6 βρέθηκε αυξημένη με ταυτόχρονα αυξημένο πυρηνικό εντοπισμό του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα που ελήφθησαν από τρεις υγιείς δότες. Στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης διερευνήθηκε κατά πόσον η εξάλειψη της πρωτεάσης Klk6 στην επιδερμίδα των ποντικών Spink5-/-, θα μπορούσε να καταστείλει την υπεραποφολίδωση και/ή φλεγμονή που σχετίζονται με το σύνδρομο Netherton. Για να διερευνηθεί πειραματικά αυτή η υπόθεση εργασίας, δημιουργήθηκε το διαγονιδιακό πρότυπο ποντικών Spink5-/-Klk6-/-, με διασταύρωση ποντικών Klk6-/- με ετερόζυγους ποντικούς Spink5+/- που εμφανίζουν φυσιολογικό φαινότυπο, καθότι οι ποντικοί Spink5-/- πεθαίνουν ομοιογενώς εντός 4-5 ωρών από την γέννηση. Βρέθηκε ότι η απαλοιφή του γονιδίου Klk6 δεν διασώζει την νεογνική θνησιμότητα των ποντικών Spink5-/- (Zingkou et al., 2019). Στους ποντικούς Spink5-/-Klk6-/- παρατηρήθηκε εκτεταμένη αποκόλληση της κεράτινης στιβάδας και μη φυσιολογική λειτουργία του δερματικού φραγμού με χρώση ηωσίνης/αιματοξυλίνης και δοκιμασία διείσδυσης με μπλε της τολουϊδίνης, αντίστοιχα. Η ζυμογραφία πηκτώματος και η in situ ζυμογραφία έδειξαν ότι η συνολική πρωτεολυτική ενεργότητα στην επιδερμίδα των ποντικών Spink5-/-Klk6-/- ήταν συγκρίσιμη με αυτή που παρατηρείται στην επιδερμίδα των ποντικών Spink5-/-. Όμως, στην επιδερμίδα των ποντικών Spink5-/-Klk6-/- είχε αποκατασταθεί φυσιολογική διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων, όπως επιβεβαιώθηκε με ανοσοχρώση, καθώς και φυσιολογική έκφραση των (κορνεο)δεσμοσωματικών πρωτεϊνών, όπως η κερατίνη 5, η ινβολουκρίνη, η λορικρίνη, η δεσμογλεΐνη 1, η δεσμοκολίνη 1 και η κορνεοδοσμοσίνη (Zingkou et al., 2019). Επιπλέον, η αδρανοποίηση του γονιδίου της KLK6 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κερατινοκυττάρων, χαρακτηριστικό του συνδρόμου, καθώς επίσης, μειώθηκε σημαντικά η έκφραση της πρωτεΐνης Ki67 στην επιδερμίδα των ποντικών Spink5-/-Klk6-/-. Αυτό θα μπορούσε να συσχετισθεί με την μειωμένη έκφραση του Tslp και άλλων φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως Tnf-α, Il-1β, Il-6, Il-17α, Il-23, Il-13 και Il-4 στο δέρμα των ποντικών Spink5-/-Klk6-/-, καθώς και τον μειωμένο αριθμό διηθητικών ιστιοκυττάρων στην δερμίδα. Η έκφραση του Par-2, ο πυρηνικός εντοπισμός του NF-κΒ και η φοσφορυλίωση του Erk1/2 βρέθηκαν μειωμένα στους ποντικούς Spink5-/-Klk6-/- σε σύγκριση με τους ποντικούς Spink5-/-, ενδεικτικό της καταστολής της ενεργοποίησης του μονοπατιού Erk1/2-NF-κΒ. Η απαλοιφή του γονιδίου Klk6 μείωσε την φλεγμονή του δέρματος μέσω του άξονα KLK6-ERK1/2-NF-ΚB-TSLP. Συμπερασματικά, η απαλοιφή του γονιδίου Klk6 δεν επαρκεί για να βελτιώσει την υπεραποφολίδωση, αποτέλεσμα της υπερβολικά αυξημένης πρωτεόλυσης, και δεν αποκατέστησε τον ελαττωματικό φραγμό του δέρματος που οδηγεί σε νεογνική θνησιμότητα. Εν τούτοις, η διαγραφή του γονιδίου Klk6 είχε σαν αποτέλεσμα την αξιοσημείωτη καταστολή της επιδερμικής φλεγμονής, όπως υποδεικνύεται από την μειωμένη έκφραση του Tslp μέσω καταστολής της οδού Erk1/2-NF-κΒ. Επιπλέον, αποκαταστάθηκε φυσιολογική επιδερμική διαφοροποίηση (Zingkou et al., 2019). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν, για πρώτη φορά, ότι η KLK6 εμπλέκεται στην φλεγμονή του δέρματος και πιθανόν αντιπροσωπεύει έναν καινοτόιμο φαρμακολογικό στόχο για το σύνδρομο Netherton, αλλά και άλλες συχνά εμφανιζόμενες φλεγμονώδεις νόσους του δέρματος, όπως η ατοπική δερματίτιδα. ΜΕΡΟΣ ΙΙ: Ομόζυγες μεταλλάξεις στο γονίδιο Cdsn, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη κορνεοδεσμοσίνη, είναι υπεύθυνες για την νόσο PSD (PSD, type B peeling skin disease), μια αυτοσωμική υπολειπόμενη ασθένεια που χαρακτηρίζεται από ιχθύαση, ερυθροδερμία και απολέπιση του δέρματος (Bowden PE, 2011). Διαγονιδιακοί ποντικοί Cdsn-/- αναπαράγουν τα κλινικά συμπτώματα της ανθρώπινης νόσου PSD, όπως η υπεραποφολίδωση η οποία οδηγεί σε νεογνική θνησιμότητα λόγω σοβαρής αφυδάτωσης (Leclerc et al., 2009). Υπέρ-ενεργοποίηση της σερινοπρωτεάσης KLK5 έχει συσχετισθεί με σοβαρές ιχθυάσεις, όπως η νόσος PSD. Υποθέσαμε ότι η απαλοιφή του γονιδίου Klk5 θα μπορούσε να αναστρέψει την υπεραποφολίδωση και/ή την φλεγμονή στο δέρμα PSD. Για να ελεγχθεί πειραματικά αυτή η υπόθεση, δημιουργήθηκαν ποντικοί Cdsn-/-Klk5-/- με διασταύρωση ποντικών Klk5-/- με ετερόζυγους ποντικούς Cdsn+/-, οι οποίοι παρουσιάζουν φυσιολογικό φαινότυπο, δεδομένου ότι οι ποντικοί Cdsn-/- πεθαίνουν ομοιογενώς εντός 30 λεπτών της ώρας μετά την γέννηση. Η μακροσκοπική και ιστολογική εξέταση των νεογέννητων ποντικών Cdsn-/-Klk5-/- και βιοψιών του δέρματος, που απομονώθηκαν από τους ποντικούς αυτούς, έδειξε αντίστοιχα ότι απαλοιφή του γονιδίου Klk5 δεν αντιστρέφει τον θανατηφόρο φαινότυπο της νόσου PSD στους ποντικούς και δεν επαρκεί για να αποκαταστήσει φυσιολογική δομή στο δέρμα. Η χρώση των ποντικών Cdsn-/-Klk5-/- με την χρωστική κυανούν της τολουϊδίνης έδειξε ότι δεν είχε αποκατασταθεί η εκτεταμένη βλάβη του δερματικού φραγμού. Ζυμογραφία πηκτώματος ζελατίνης και in situ ζυμογραφία έδειξαν ότι η αυξημένη πρωτεόλυση δεν καταστέλλεται στην επιδερμίδα. Συμπερασματικά, η στοχευμένη αδρανοποίηση του γονιδίου Klk5 δεν μειώνει σημαντικά την έκτοπα ενεργοποιημένη πρωτεόλυση ούτε την υπεραποφολίδωση στην επιδερμίδα των ποντικών Cdsn-/-, έτσι, δεν μπορεί να διασώσει την νεογνική θνησιμότητα των ποντικών Cdsn-/-. Ωστόσο, η αδρανοποίηση του γονιδίου Klk5 είχε ως αποτέλεσμα να αποκατασταθεί φυσιολογική επιδερμική διαφοροποίηση. Απαρτιωμένες μεταγραφωματικές και αποικοδομητικές (degradomics) αναλύσεις ευρίσκονται σε εξέλιξη με στόχο την ταυτοποίηση εναλλακτικών πρωτεασών που είναι ενεργές στην επιδερμίδα ασθενών με νόσο PSD. | el |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10889/15682 | |
| dc.language.iso | en | el |
| dc.subject | Kallikrein-related peptidase 6 | el |
| dc.subject | Skin inflammation | el |
| dc.subject | Netherton syndrome | el |
| dc.subject | Peeling skin syndrome | el |
| dc.subject.alternative | Πρωτεάσες σερίνης καλλικρεΐνη 6 | el |
| dc.subject.alternative | Φλεγμονή του δέρματος | el |
| dc.subject.alternative | Σύνδρομο Netherton | el |
| dc.subject.alternative | Σύνδρομο απολέπισης δέρματος | el |
| dc.title | Novel transgenic models for the delineation of mechanisms regulating proteolysis and inflammation in skin diseases | el |
| dc.title.alternative | Νέα διαγονιδιακά πρότυπα για την διαλεύκανση των μηχανισμών πρωτεόλυσης και φλεγμονής σε δερματικά νοσήματα | el |
| oaire.licenseCondition | null | el |
Files
Original bundle
1 - 1 of 1
Loading...
- Name:
- Novel transgenic models for the delineation of mechanisms regulating proteolysis and inflammation in skin diseases_MSc_Charla.pdf
- Size:
- 6.47 MB
- Format:
- Adobe Portable Document Format
License bundle
1 - 1 of 1
No Thumbnail Available
- Name:
- license.txt
- Size:
- 4.53 KB
- Format:
- Item-specific license agreed upon to submission
- Description: