Λειτουργικός χαρακτηρισμός της πρωτεΐνης McIdas κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου
Loading...
Date
Authors
Τσαρίδου, Σταυρούλα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας στα διαιρούμενα κύτταρα απαιτεί τον αυστηρό συντονισμό της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής διαίρεσης. Αυτές οι διεργασίες ρυθμίζονται μέσω πολλαπλών μηχανισμών οι οποίοι περιλαμβάνουν την ύπαρξη διαφόρων σημείων ελέγχου αλλά και τη σωστή χρονική ιεράρχηση της πρωτεόλυσης βασικών κυτταρικών ρυθμιστών μέσω του συστήματος ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος. Το σύμπλοκο προώθησης της ανάφασης/κυκλόσωμα (APC/C) είναι μια Ε3 λιγάση της ουβικουϊτίνης το οποίο έχει την ικανότητα να αναγνωρίζει και να πολυουβικουιτινιλιώνει μια πληθώρα υποστρωμάτων κατά τη μίτωση και τη G1 φάση οδηγώντας τα στο πρωτεάσωμα για αποικοδόμηση. Οι πρωτεΐνες Geminin, GemC1 και McIdas συγκροτούν μια οικογένεια η οποία συμμετέχει τόσο στην αντιγραφή του DNA όσο και σε διαδικασίες διαφοροποίησης.
Η Geminin, το πρώτο μέλος της οικογένειας που χαρακτηρίστηκε, δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της αντιγραφής μέσω του σχηματισμού συμπλόκου με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1. Πιο πρόσφατα, οι πρωτεΐνες GemC1 και McIdas ανακαλύφθηκαν μέσω της ομολογίας που εμφανίζουν με την Geminin στην περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος που διαθέτουν. Ο παράγοντας GemC1 δρα κατά την αντιγραφή του DNA μέσω αλληλεπίδρασης με τον παράγοντα TopBP1 για την στρατολόγηση του Cdc45 στο προεναρκτήριο σύμπλοκο της αντιγραφής. Ο παράγοντας McIdas χαρακτηρίστηκε για τη συμμετοχή του στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω του συμπλόκου που σχηματίζει με την Geminin, καθώς απουσία του οδηγεί στη συσσώρευση καρκινικών κυττάρων στην S φάση και αδυναμία εισόδου στην μίτωση και την ακόλουθη G1 φάση. Έχει δειχθεί ότι ο McIdas αποικοδομείται κατά την ανάφαση μετά την Geminin η οποία αποτελεί γνωστό υπόστρωμα του συμπλόκου προώθησης της ανάφασης. Αδημοσίευτα δεδομένα του εργαστηρίου κατέδειξαν ότι η πρωτεόλυση του McIdas πραγματοποιείται ομοίως από το APC/C. Επιπλέον, εκτοπική έκφραση του McIdas έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ανώμαλων πολυπολικών μιτωτικών ατράκτων και πολυπύρηνων κυττάρων αποκαλύπτοντας τον πιθανό ρόλο του McIdas στο διπλασιασμό των κεντροσωματίων καθώς αυτοί οι φαινότυποι παρατηρούνται χωρίς τη μεσολάβηση κυτταροκίνησης. Πρόσφατες μελέτες στο εργαστήριό μας έδειξαν ότι ο McIdas εντοπίζεται στα κεντριόλια και είναι σημαντικός για τον κύκλο των κεντροσωματίων.
Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία, μελετήθηκε περαιτέρω ο ρόλος του McIdas κατά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και η σημασία του χρονικού της αποικοδόμησής του για τη λειτουργία του. Για αυτό το σκοπό, στο πρώτο μέρος της εργασίας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα αποσιώπησης του McIdas σε κύτταρα hTERT-RPE1, μια αθανατοποιημένη μη καρκινική κυτταρική σειρά από τον αμφιβληστροειδή και έδειξαν ότι απουσία του McIdas τα κύτταρα συσσωρεύονται στην S ή G2 φάση του κυτταρικού κύκλου. Ύστερα από επώαση με BrdU για μεγάλο χρονικό διάστημα (BrdU cumulative assay) παρατηρήθηκε ότι το σύνολο των κυττάρων που αντιγράφεται και διαιρείται ενεργά παραμένει μειωμένο με την πάροδο του χρόνου υποδεικνύοντας την αναγκαιότητα του McIdas για την ομαλή διεξαγωγή του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός δράσης του χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.
Για την αποικοδόμηση του McIdas, το N-τελικό του άκρο είναι επαρκές για να καταλύσει τη διαδικασία αναγνώρισης και καταστροφής της πρωτεΐνης κατά τη μίτωση. Στο δεύτερο μέρος αυτής της μελέτης εντοπίστηκαν δύο συντηρημένες αλληλουχίες καταστροφής στο N-τελικό άκρο του McIdas οι οποίες ομοιάζουν με τα γνωστά D-Box και ABBA μοτίβα. Μεταλλάγματα του McIdas για αυτές τις περιοχές αδυνατούν να αποικοδομηθούν κατά την ανάφαση ενώ παράλληλα κυτταρικές σειρές οι οποίες εκφράζουν σταθερά αυτά τα μεταλλάγματα εμφανίζουν ανώμαλους μιτωτικούς φαινοτύπους. Αυτοί περιλαμβάνουν την ύπαρξη χρωματινικών γεφυρών, μικροπυρήνων και πολυπύρηνων κυττάρων. Επιπλέον, με την σταθεροποίηση του McIdas κατά τη μίτωση, προκύπτει αυξημένος αριθμός κεντροσωματίων και πολυπολικών μιτωτικών ατράκτων επιβεβαιώνοντας τη συμμετοχή του McIdas στον διπλασιασμό των κεντροσωματίων. Παρόλα αυτά, φαίνεται ότι δεν επηρεάζεται το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων αυτών.
Από όλα τα παραπάνω δεδομένα συμπεραίνεται ότι η πρωτεΐνη McIdas είναι ζωτικής σημασίας τόσο για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου όσο και για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας.
Description
Keywords
Κυτταρικός κύκλος, Γονιδιωματική σταθερότητα