Ο ρόλος των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1 και Cdc6 στην γονιδιακή ενίσχυση και στην ανθεκτικότητα σε αντικαρκινικά φάρμακα
Loading...
Date
Authors
Πετρόπουλος, Μιχαήλ
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, η διαδικασία της αδειοδότησης της αντιγραφής εξασφαλίζει την διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Η αδειοδότηση της αντιγραφής πραγματοποιείται από το τέλος μίτωσης έως την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και επιτρέπει την αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος μόνο μια φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο. Σημαντικό παράγοντα σε αυτή την διαδικασία αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία είναι ενεργή από το τέλος της μίτωσης έως την G1 φάση και συνεργάζεται με τους παράγοντας Cdc6 και ORC ώστε να στρατολογήσει μόρια ελικασών MCM2-7 στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής. Στα μετάζωα, ο παράγοντας Cdt1 ρυθμίζεται αρνητικά από την Geminin από την φάση S έως την μίτωση. Διάφορες in vitro και in vivo μελέτες έχουν δείξει ότι η απορρύθμιση της έκφρασης των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1 και Cdc6 συμβάλλουν στην πρόκληση γονιδιωματικής αστάθειας και ακολούθως στην εξέλιξη της καρκινογένεσης. Η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί μια μορφή γονιδιωματικής αστάθειας η οποία είναι συχνό φαινόμενο στα καρκινικά κύτταρα. Η γονιδιακή ενίσχυση συμμετέχει στην προαγωγή της καρκινογένεσης μέσω της ενεργοποίησης ογκογονιδίων καθώς και μέσω της αύξησης των αντιγράφων γονιδίων που παίζουν ρόλο στην εκδήλωση ανθεκτικότητας σε φάρμακα. Παράλληλα, τα γονίδια που ενισχύονται στους διάφορους καρκίνους αποτελούν δείκτες πρόγνωσης και απόκρισης στην θεραπεία.
Στόχος της μελέτης ήταν να διερευνηθεί εάν η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί άμεση συνέπεια της επαναντιγραφής εξαιτίας της υπερέκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Cdc6. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο η ανθεκτικότητα στο αντικαρκινικό φάρμακο μεθοτρεξάτη. Αρχικά εκτιμήθηκε η τοξικότητα του φαρμάκου σε NIH3T3 κύτταρα και υπολογίστηκε η μέση θανατηφόρος δόση μέσω της τεχνικής ΜΤΤ. Στην συνέχεια, σε κύτταρα NIH3T3 τα οποία υπερεκφράζουν τους παράγοντες Cdt1 και Cdc6 ελέγχθηκε η εκδήλωση ανθεκτικότητας στην μεθοτρεξάτη μέσω του σχηματισμού ανθεκτικών αποικιών. Πράγματι, η εκτοπική έκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 οδήγησε στην εμφάνιση μεγαλύτερης συχνότητας ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη. Κύριος μηχανισμός ανθεκτικότητας στο συγκεκριμένο φάρμακο, αποτελεί η αυξημένη ενεργότητα του ενζύμου DHFR, εξαίτιας ενίσχυσης του αντίστοιχου γονιδίου. Για το σκοπό αυτό, ελέγχθηκαν τα αντίγραφα του γονιδίου DHFR στις ανθεκτικές στην μεθοτρεξάτη αποικίες με την χρήση της Real-Time PCR. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε αύξηση των αντιγράφων του γονιδίου DHFR.Μελέτες έχουν δείξει ότι σημαντικό μηχανισμό στην δημιουργία της γονιδιακής ενίσχυσης διαδραματίζουν οι διπλές κατατμήσεις στο γενετικό υλικό. Επόμενος στόχος ήταν να ελέγξουμε εάν η εκτοπική έκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 είναι ικανή να επάγει την πρόκληση αντιγραφικού στρες και την δημιουργία διπλών κατατμήσεων στο γενετικό υλικό. Για το σκοπό αυτό, ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των δεικτών βλάβης γH2AX και pRPA32 με την χρήση ανοσοφθορισμού και μετρήθηκε η μέση ένταση του φθορισμού με την χρήση του προγράμματος ImageJ. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 επάγει τον σχηματισμό διπλών κατατμήσεων στο γενετικό υλικό. Σύμφωνα με όλα τα παραπάνω, η απορρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη της καρκινογένεσης μέσω αύξησης των αντιγράφων συγκεκριμένων γονιδίων.
Description
Keywords
Αντιγραφή του DNA, Γονιδιακή ενίσχυση, Ανθεκτικότητα σε φάρμακα, Καρκίνος