Γρήγορα διαγνωστικά τεστ νουκλεϊκών οξέων – βιοαισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων
Loading...
Date
2023-02-08
Authors
Μπάκα, Ελένη
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Οι βιοαισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων αποτελούν ένα οικονομικό, ταχύ και αποτελεσματικό αναλυτικό εργαλείο. Αρκετοί βιοαισθητήρες αυτού του τύπου περιλαμβάνουν την ανίχνευση βιομορίων, όπως πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα με τη χρήση διάφορων ιχνηθετών, όπως χημειοφωταυγάζουσες ενώσεις, έγχρωμα νανοσφαιρίδια, χρωστικές ουσίες και κβαντικές τελείες. Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός νέου και γρήγορου διαγνωστικού τεστ τύπου ταινίας με στόχο την αυξημένη ανιχνευσιμότητα ειδικών αλληλουχιών DNA. Το τεστ αυτό στηρίχθηκε σε νανοσωματίδια χρυσού για οπτική ανίχνευση δια γυμνού οφθαλμού.
Η μελέτη βασίστηκε σε διαφορετικά πρωτόκολλα ανίχνευσης με τον βιοαισθητήρα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ενίσχυση μιας αλληλουχίας DNA που έλαβε χώρα στην επιφάνεια μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου, τα οποία είχαν προηγουμένως συζευχθεί με τον έναν εκκινητή της αντίδρασης. Μόρια βιοτίνης εισήχθησαν μέσω b-dCTP στο προϊόν κατά την αντίδραση πολυμερισμού. Στόχος ήταν η συμπύκνωση των μικροσφαιριδίων μέσω φυγοκέντρησης και η ανάλυση όλου του PCR προϊόντος με τον βιοαισθητήρα. Ακολούθως, πάνω στην ίδια λογική πραγματοποιήθηκε η ανάλυση προϊόντος PEXT για την ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Καθώς τα πρωτόκολλα αυτά δεν έδωσαν θετικά αποτελέσματα στην κατεύθυνση αύξησης της ανιχνευσιμότητας, το ενδιαφέρον στράφηκε σε μια άλλη δοκιμή που περιλάμβανε την υβριδοποίηση ενός βιοτινυλιωμένου PCR προϊόντος με ένα συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτή που έφερε μια πολυαδενυλική ουρά. Στη συνέχεια, τα υβρίδια δεσμεύτηκαν πάνω στα μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου, τα οποία είχαν προηγουμένως συζευχθεί με μια πολυθυμιδιλική αλυσίδα. Ακολούθησε συμπύκνωση με φυγοκέντρηση και εναπόθεση των μικροσφαιριδίων με το προϊόν PCR πάνω στη μεμβράνη του βιοαισθητήρα, ώστε να στεγνώσουν και να πραγματοποιηθεί η δοκιμή με τη χρήση νανοσωματιδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι της βιοτίνης. Η δοκιμασία αυτή έδωσε τα επιθυμητά αποτελέσματα και επιτεύχθηκε αύξηση της ανιχνευσιμότητας σε σχέση με τις κλασικές δοκιμές τουλάχιστον 100-1000 φορές, καθώς οδήγησε σε ανίχνευση λιγότερο από 10 ag εισαχθέν στην αντίδραση PCR γενωμικού DNA.
Description
Keywords
Βιοαισθητήρες τύπου ταινίας, Γρήγορα τεστ, Νανοσωματίδια χρυσού, Μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου, Οπτική ανίχνευση, Αύξηση ανιχνευσιμότητας