Παραγωγή, απομόνωση και χαρακτηρισμός της δράσης μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης
Loading...
Date
2012-05-08
Authors
Κουτρουμπή, Σταματίνα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι πενταμερή διαμεμβρανικά γλυκοπρωτεϊνικά μόρια τα οποία ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των συνδεόμενων με προσδέτη ιοντικών καναλιών και ανάλογως με τη θέση τους στα σπονδυλωτά διακρίνονται σε νευρικού τύπου και μυϊκού τύπου. Ο μυϊκός nAChR συναντάται στη νευρομυΪκή σύναψη και έχει στοιχειομετρία (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ. Στους νευρικού τύπου nAChRs, μεταξύ άλλων ανήκει και ο α4β2 υποδοχέας ο οποίος συναντάται σε υψηλά επίπεδα στον εγκέφαλο του ανθρώπου και εμφανίζεται με τη στοιχειομετρία (α4)2(β2)3 ή (α4)3(β2)2. Αποτελέσματα μελετών έχουν δείξει ότι ο υποδοχέας αυτός εμπλέκεται σε νευροεκφυλιστικές νόσους – Alzheimer, Parkinson, σχιζοφρένεια – καθώς και στον εθισμό στο κάπνισμα. Για το λόγο αυτό ο α4β2 υποδοχέας αποτελεί σημαντικό στόχο για το σχεδιασμό φαρμάκων και συνεπώς οι πληροφορίες που αφορούν τη δομή του και κυρίως το εξωκυτταρικό τμήμα του (ECD) – όπου συναντώνται οι θέσεις πρόσδεσης των προσδετών – είναι σημαντικές. Στο εργαστήριό μας έχει κατασκευαστεί και εκφράζεται στο ζυμομύκητα Pichia pastoris ένα συγκαταμερές το οποίο αποτελείται από τα ECDs των υπομονάδων β2 και α4 συνδεδεμένα σε σειρά μέσω ενός πεπτιδίου 24 αμινοξικών καταλοίπων (β2-α4). Η υψηλή υδροφιλικότητα και οι καλές ιδιότητες πρόσδεσης συνδετών αποτελούν σπουδαία πλεονεκτήματα που καθιστούν το συγκαταμερές αυτό σημαντικό μόριο για προσπάθειες κρυσταλλογραφικής ανάλυσης. Στηριζόμενοι σε αποτελέσματα μελετών που έχουν δείξει ότι μόρια που δεν κρυσταλλώνονται εύκολα μόνα τους, μπορούν να κρυσταλλωθούν ευκολότερα αν συνδεθούν με άλλα πρωτεϊνικά μόρια, έγινε η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων (mAbs) έναντι του β2α4 ώστε τμήματα των mAbs που θα προκύψουν από πέψη αυτών με παπαΐνη (Fab τμήματα) να συγκρυσταλλωθούν μελλοντικά με το β2-α4.
Στο πρώτο μέρος της εργασίας πραγματοποιήθηκε η παραγωγή mAbs έναντι του β2-α4. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της κυτταρικής σύντηξης μυελωματικών κυττάρων και σπληνικών κυττάρων αρουραίου ανοσοποιημένου έναντι του β2-α4. Αποτέλεσμα της μεθόδου αυτής είναι η παραγωγή υβριδωμάτων καθένα από τα οποία εκκρίνει ένα συγκεκριμένο mAb. Στη συνέχεια αυτής της διαδικασίας έγινε η επιλογή έξι υβριδώματων από τα οποία εκκρίνονταν αντίστοιχα έξι mAbs (mAbNR1-mAbNR6) με διαφορετικές ικανότητες πρόσδεσης. Πέντε από τα έξι mAbs αποδείχθηκε ότι προσδένουν είτε στη β2 είτε στην α4 υπομονάδα ενώ ένα από αυτά (mAbNR6) φαίνεται να προσδένει στη διεπιφάνεια των δύο υπομονάδων. Τα αντισώματα mAbNR2 και mAbNR3 παρουσιάζουν υψηλή ικανότητα πρόσδεσης αυστηρά για στην β2 και α4 υπομονάδα αντίστοιχα, ενώ τα υπόλοιπα αντισώματα πραγματοποιούν διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις και με άλλες υπομονάδες. Πειράματα με ολόκληρο τον ανθρώπινο υποδοχέα α4β2 έδειξαν ότι το mAbNR2 προσδένει και σε αυτόν, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το αντίσωμα αυτό θα μπορούσε να αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο και για τον εντοπισμό του α4β2 υποδοχέα σε ανθρώπινο νευρικό ιστό.
Στο δεύτερο μέρος της εργασίας πραγματοποιήθηκε απομόνωση και στη συνέχεια πέψη του mAbNR2 καθώς και άλλων δύο μονοκλωνικών αντισωμάτων του εργαστηρίου mAb73 (έναντι της β1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR) και mAb198 (έναντι της α1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR). Τα αντισώματα αυτά απομονώθηκαν από καλλιέργειες υβριδωμάτων και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε πέψη αυτών για τη δημιουργία Fab τμημάτων. Τα τμήματα Fab χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για τη δημιουργία συμπλόκων με τις αντίστοιχες υπομονάδες με σκοπό τη συγκρυστάλλωση. Τελικός σκοπός αυτής της διαδικασίας είναι η μελέτη της δομής των nAChRs και των υπομονάδων τους καθώς και η διευρεύνηση του τρόπου αλληλεπίδρασης αυτών με τα αντισώματα.
Description
Keywords
Νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης, Μονοκλωνικά αντισώματα