Δομικές μελέτες της επικράτειας SARS Unique Domain (SUD) του SARS-CoV-2 με τον ενδοκυτταρικό συνεργάτη της, την ανθρώπινη πρωτεΐνη RCHY1, μέσω βιοφυσικών μελετών
Loading...
Date
2023-12-20
Authors
Ματακούλη, Ευτυχία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Ο ιός SARS-CoV-2 αποτελεί έναν εξαιρετικά παθογόνο ιό, αιτία της παγκόσμιας πανδημίας COVID-19. Το γονιδίωμα του ιού αποτελείται από ένα θετικής πολικότητας μονόκλωνο RNA, που κωδικοποιεί, μεταξύ άλλων, 16 μη δομικές πρωτεΐνες (nsPs), απαραίτητες για την δημιουργία του συμπλέγματος αντιγραφής-μεταγραφής. Η μεγαλύτερη από αυτές, η nsP3, απαρτίζεται από ανεξάρτητες επικράτειες, συμπεριλαμβανομένης της SARS-unique domain (SUD) και της πρωτεάσης που ομοιάζει με την παπαΐνη, PLpro. Η SUD επικράτεια αποτελείται από τρεις επιμέρους επικράτειες, τις SUD-N, SUD-M και SUD-C. Η SUD-C υιοθετεί μια αναδίπλωση παρόμοια με αυτή της φραταξίνης, ενώ οι SUD-N και SUD-M, υιοθετούν αναδίπλωση παρόμοια με αυτή των macro επικρατειών, διαθέτοντας υψηλή συγγένεια δέσμευσης για μη κανονικές δομές ολιγονουκλεοτιδίων πλούσιων σε γουανίνη, που ονομάζονται G-quadruplexes. Ακόμα, οι SUD επικράτειες αλληλεπιδρούν με την hPaip1, ενισχύοντας την μετάφραση του ιικού γονιδιώματος. Από την άλλη, η PLpro, πέπτει τις pp1a και pp1ab, απελευθερώνοντας τις nsP1, nsP2 και nsP3 και καταστέλλει την έμφυτη ανοσολογική απόκριση του ξενιστή, αναστρέφοντας πρωτεϊνικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών αυτού από μόρια ουβικιτίνης ή ISG15, ενώ διαθέτει και ικανότητα απευθείας πέψης του ρυθμιστικού παράγοντα της ιντερφερόνης 3 (IRF3). Τέλος, τόσο η SUD-NM όσο και η PLpro του ιού SARS-CoV αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες των κυττάρων ξενιστών, συμπεριλαμβανομένης της E3 λιγάσης RCHY1.
Η αντιική πρωτεΐνη p53 αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της RCHY1, ενώ η RCHY1 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής του παράγοντα αυτού και ιδιαίτερα της μεταγραφικά ενεργούς μορφής του. Επομένως, αυξημένα επίπεδα της p53 οδηγούν στην πολυ-ουβικιτινίωσή της και κατ’ επέκταση, στην πρωτεολυτική της αποικοδόμηση. Ακόμα, η αλληλεπίδραση μεταξύ της RCHY1 με την SUD-ΝΜ επικράτεια ή την PLpro του ιού SARS-CoV σταθεροποιεί την E3 λιγάση, επάγοντας την περαιτέρω πολυ-ουβικιτινίωση της ενδογενούς p53. Η SUD-ΝΜ επικράτεια του ιού SARS-CoV αλληλεπιδρά με μια περιοχή μεταξύ των καταλοίπων 95-144 της RCHY1, ενώ απαραίτητες για την αλληλεπίδραση είναι τόσο η SUD-Ν όσο και η SUD-Μ επικράτεια. Δεδομένης, λοιπόν, της υψηλής αμινοξικής ταυτοσημίας που διαθέτει η SUD-NM επικράτεια και η πρωτεάση PLpro του ιού SARS-CoV-2, με τις αντίστοιχες του ιού SARS-CoV, είναι πιθανό να εμφανίζουν παρόμοιες λειτουργίες, όσον αφορά τη συμμετοχή τους στην ιική αναπαραγωγή και την σταθεροποίηση της Ε3 λιγάσης hRCHY1.
Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε η έκφραση και η απομόνωση των πολυπεπτιδίων των τομέων NTD και NTD-RING της hRCHY1, αλλά και των πολυπεπτιδίων της επικράτειας SUD-NM και της πρωτεάσης PLpro του ιού SARS-CoV-2. Επιπλέον, διεξήχθη ο βιοφυσικός χαρακτηρισμός των πολυπεπτιδίων μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού (CD), χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού συνδεδεμένης με ανιχνευτή σκέδασης φωτός πολλαπλών γωνιών (SEC-MALS) και φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Τέλος, διενεργήθηκαν πειράματα τιτλοδότησης, προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανότητα αλληλεπίδρασης των πολυπεπτιδίων της hRCHY1 με τις επικράτειες SUD-NM και PLpro του ιού SARS-CoV-2, με τη χρήση θερμιδομετρίας ισοθερμικής τιτλοδότησης (ITC), φασματοσκοπίας NMR, αλλά και δοκιμασιών συγκατακρήμνισης σε χρωματογραφική στήλη.
Description
Keywords
Ουβικιτινίωση, Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού