Διερεύνηση της αλληλεπίδρασης αιμοπεταλίων και ενήλικων νευρικών βλαστικών κυττάρων της υποεπενδυματικής ζώνης
Loading...
Date
Authors
Δημητρίου, Χριστίνα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Μετά την ολοκλήρωση της εμβρυικής και πρώιμης μεταγεννητικής ανάπτυξης του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) των θηλαστικών, Νευρικά Βλαστικά Κύτταρα (ΝΒΚ) επιβιώνουν σε εξειδικευμένα μικροπεριβάλλοντα, τις φωλεές βλαστικών κυττάρων (ΦΒΚ), όπως η Υποεπενδυματική Ζώνη (ΥΕΖ) των πλάγιων κοιλιών του εγκεφάλου. Τα ΝΒΚ της ΥΕΖ μεταναστεύουν μέσω του πρόσθιου μεταναστευτικού ρεύματος στους οσφρητικούς βολβούς όπου διαφοροποιούνται σε λειτουργικούς νευρώνες, ενώ ένα μικρό ποσοστό διαφοροποιείται σε ολιγοδενδρογλοιακά προγονικά κύτταρα, τα οποία εγκαθίστανται στο μεσολόβιο. Το αγγειακό σύστημα αποτελεί βασικό ρυθμιστικό στοιχείο της ΥΕΖ. Τα ΝΒΚ επικοινωνούν με τα αγγεία μέσω μίας μακριάς αποφυάδας. Περιαγγειακά παρατηρούνται μιτωτικώς ενεργά ΝΒΚ, ενώ, άμεσες και έμμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ΝΒΚ και των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων ελέγχουν τη διατήρηση, την κυτταρική μοίρα, τον πολλαπλασιασμό και τον quiescent χαρακτήρα της φωλεάς. Η λειτουργική διαφοροποίηση των αγγείων της ΥΕΖ συνυπάρχει και με ανατομικές ιδιαιτερότητες, όπως μεγαλύτερη πυκνότητα δικτύου, αυξημένη διαπερατότητα των αγγείων και χαμηλή ροή οξυγόνου.
Βιβλιογραφικά έχει αναφερθεί, η εμπλοκή των αιμοπεταλίων σε αναγεννητικές διαδικασίες του ΚΝΣ. Λειτουργικά, πέραν της αιμόστασης, διαθέτουν επίσης αντιφλεγμονώδεις, αγγειογενετικές και ιστοαναπλαστικές ιδιότητες. Αυτές σχετίζονται με υποκυτταρικές δομές που φέρουν, τα α-κοκκία, «πυκνά» κοκκία και λυσοσώματα, όπου εδράζεται πληθώρα δραστικών παραγόντων, οι οποίοι υπό συνθήκες, εκκρίνονται μαζικά στον εξωκυττάριο χώρο δρώντας σε κύτταρα στόχους. Μετά από τραυματισμό ή βλάβη του ΚΝΣ, τα αιμοπετάλια εμπλέκονται στην οξεία φλεγμονώδη αντίδραση και κατ’ επέκταση σε περιπτώσεις σηψαιμίας, ανοσολογικών διαταραχών, σε παθολογίες όπως η Σκλήρυνση κατά Πλάκας και η ισχαιμία. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος των αιμοπεταλίων στις ΦΒΚ και ο τρόπος αλληλεπίδρασης με τους κυτταρικούς πληθυσμούς των ΝΒΚ και των απογόνων τους παραμένει ασαφής.
Πρόσφατα, αποκαλύφθηκε πως πειραματική εστιασμένη απομυελίνωση στο μεσολόβιο μυών επιφέρει συσσώρευση αιμοπεταλίων (CD41+) στα αιμοφόρα αγγεία (Laminin+) της ΥΕΖ των πλάγιων κοιλιών, ενώ αιμοπεταλιακοί παράγοντες ευνοούν την επιβίωση των ΝΒΚ in vitro. Σκοπό της παρούσας εργασίας αποτελεί η μελέτη της άμεσης διακυτταρικής (cell-to-cell) αλληλεπίδρασης μεταξύ NBK και αιμοπεταλίων.
Στην παρούσα εργασία, αρχικά, εγκαθιστούμε σύστημα συγκαλλιεργειών in vitro, όπου σε πρωτογενείς καλλιέργειες ΝΒΚ προερχόμενων από την απομόνωση της ανατομικής περιοχής της ΥΕΖ των πλάγιων κοιλιών του εγκεφάλου ενήλικων μυών, προστίθενται σε διαφορετικές πυκνότητες «καθαρά», μη-ενεργοποιημένα αιμοπετάλια απομονωμένα από δείγμα ολικού αίματος συλλεχθέν από την IVC ενήλικων μυών. Οι συγκαλλιέργειες διατηρούνται σε συνθήκες πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης για πολλαπλά χρονικά διαστήματα και αξιολογούνται με τη διενέργεια χρώσεων ανοσοφθορισμού βάσει μοριακών κυτταρικών δεικτών για το βλαστικό/προγονικό χαρακτήρα (Nestin, Sox2), τον πολλαπλασιασμό (Ki67, PCNA), την κυτταρική μοίρα (Olig2, Dcx, GFAP) και τον εντοπισμό αιμοπεταλίων (CD41, CD62P). Παράλληλα, επεκτείνουμε τη διερεύνηση in vivo, με τη χρήση διαγονιδιακών μυών με διαταραγμένο αριθμό αιμοπεταλίων (θρομβοκυτταροπενία: Nbeal2-/-, Crlf3-/-, θρομβοκυττάρωση: JAK2V6fl/+), στους οποίους προκαλείται τοπική απομυελίνωση σε υπερκείμενη της ΥΕΖ περιοχή του μεσολοβίου με έγχυση λυσολεκιθίνης και έπειτα αξιολογείται ιστολογικά η απόκριση στον τραυματισμό των κυτταρικών πληθυσμών της ΥΕΖ και του μεσολοβίου, καθώς και του αγγειακού συστήματος της ΥΕΖ. Επιπρόσθετα, αξιολογούμε την απόκριση της ΥΕΖ σε περιπτώσεις άλλων διαταραχών, όπως ισχαιμία και διαταραχή του επενδύματος, καθώς και την απόκριση της ΥΕΖ και της μέλαινας ουσίας, μίας μη «τυπικής» νευρογενετικής ζώνης, σε μύες αγρίου τύπου και σε παρκινσονικούς μύες weaver έπειτα από μακρά χορήγηση της μικρονευροτροφίνης BNN-20. Τέλος, σε μύες wild type (WT), διενεργούμε ετερόλογη μεταμόσχευση σημασμένων με φθορίζουσα χρωστική (PKH26), μη-ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων από μύες WT στο ραχιαίο τμήμα της ΥΕΖ και στο ραχιαίο τμήμα του Ραβδωτού Σώματος και εξετάζουμε την απόκριση του ιστού στο εξωγενές μόσχευμα αιμοπεταλίων.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πως η συγκαλλιέργεια των ΝΒΚ με αυξημένο αριθμό αιμοπεταλίων, επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των βλαστοκυττάρων, με τρόπο που εξαρτάται από την παρουσία ή μη μιτογόνων παραγόντων στο περιβάλλον τους˙ οδηγώντας σε αύξηση και μείωση της μιτωτικής δραστηριότητας τους, απουσία και παρουσία αυξητικών παραγόντων, αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, η παρουσία υψηλού αριθμού αιμοπεταλίων στις συγκαλλιέργειες αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων της ολιγοδενδρογλοιακής μοίρας (Olig2+) παρουσία αυξητικών παραγόντων, χωρίς να τον επηρεάζει απουσία αυτών, υποδεικνύοντας πως τα αιμοπετάλια δρουν στο στάδιο της δέσμευσης (commitment) των ΝΒΚ προς την ολιγοδενδρογλοιακή μοίρα, in vitro. Ωστόσο, όταν οι συγκαλλιέργειες των ΝΒΚ μυών WT διενεργούνται με αιμοπετάλια προερχόμενα από μύες Nbeal2-/- (50% του φυσιολογικού αριθμού αιμοπεταλίων, απουσία α-κοκκίων), δεν παρατηρείται κάποια επίδραση τόσο στον πολλαπλασιασμό, όσο και στη διαφοροποίηση των ΝΒΚ, προτείνοντας τον ενδεχόμενο ρόλο των α-κοκκίων στην άμεση αλληλεπίδραση ΝΒΚ και αιμοπεταλίων. Ακολούθως, έπειτα από ιστολογική ανάλυση, εντοπίζουμε αδυναμία απόκρισης των αγγείων (Laminin+) της ΥΕΖ έπειτα από απομυελίνωση στους μύες με διαταραγμένο αριθμό αιμοπεταλίων και μειωμένη ενεργοποίηση των ολιγοδενδρογλοιακών προγονικών κυττάρων (Nkx2.2+) στο ημισφαίριο του τραυματισμού στην ΥΕΖ και στο μεσολόβιο στους θρομβοκυττοπενικούς μύες. Τα αιμοπετάλια δεν εντοπίστηκαν στην περιοχή της ΥΕΖ έπειτα από ισχαιμία, και διαταραχή του επενδύματος αλλά παρατηρήθηκαν σε αγγεία της μέλαινας ουσίας σε μύες WT και weaver που είχαν λάβει BNN-20. Τέλος, εξωγενή μεταμοσχευμένα αιμοπετάλια στην περιοχή της YEZ και του Ραβδωτού Σώματος παρατηρήθηκαν σε θέσεις δίπλα σε αγγεία και στο εσωτερικό τους.
Συνολικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν την ύπαρξη λειτουργικής αλληλεπίδρασης των αιμοπεταλίων με τα ΝΒΚ της ΥΕΖ. Τα αιμοπετάλια υποστηρίζουν τη μιτωτική δραστηριότητα των ΝΒΚ, σε συνθήκες που δεν ευνοείται ο πολλαπλασιασμός, ενώ εμπλέκονται και στη διαφοροποίηση τους, πιθανότατα προωθώντας τα προς την ολιγοδενδρογλοιακή μοίρα. Επιπλέον, η αδυναμία απόκρισης της φωλεάς έπειτα από την απομυελινωτική βλάβη στο υπερκείμενο μεσολόβιο, στους θρομβοκυττοπενικούς μύες, υπογραμμίζει τη σημασία και προεκτείνει το λειτουργικό ρόλο των αιμοπεταλίων στη ρύθμιση εν γένει της νευρογενετικής φωλιάς της ΥΕΖ, εν μέρει μέσω των α-κοκκίων που περιέχουν. Ακόμα και το BNN-20 φαίνεται να προωθεί την παρουσία τους στα αγγεία νευρογενετικών φωλεών και ενδεχομένως μέσω του ενδοθηλίου των αγγείων με το οποίο πιθανότατα αλληλεπιδρούν τα μεταμοσχευμένα αιμοπετάλια. Τέλος, δεδομένων των παρόντων αποτελεσμάτων, της βιβλιογραφικά καταγεγραμμένης σημασίας των αιμοπεταλίων για το ΚΝΣ και του γεγονότος ότι αποτελούν κυτταρικό πληθυσμό που αξιοποιείται ήδη στο πλαίσιο της κλινικής πράξης, γίνεται φανερή η μεταφραστική «απόληξη» της παραπάνω ερευνητικής δραστηριότητας ως βάση για δυνητική κλινική εφαρμογή.
Description
Keywords
Νευρικά βλαστικά κύτταρα, Υποεπενδυματική ζώνη, Αιμοπετάλια, Νευροαγγειακή μονάδα