Μελέτες της λειτουργικής συμμετοχής της La πρωτεΐνης του Dictyostelium discoideum στην ωρίμανση πρόδρομων μορίων tRNA
Loading...
Date
2012-05-30
Authors
Αποστολίδη, Μαρία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η La πρωτεΐνη περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο ως αυτοαντιγόνο το οποίο αναγνωρίζεται από αντισώματα που είναι παρόντα στον ορό ασθενών που πάσχουν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus) και σύνδρομο Sjögren. Είναι γνωστό σήμερα ότι συμμετέχει ενεργά στη βιογένεση μικρών μορίων RNA, συμπεριλαμβανομένου της ιδιότητάς της να συνδέεται και να προστατεύει την 3’ ακόλουθη αλληλουχία των πρόδρομων tRNA μεταγράφων. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι in vivo διευκολύνει την απομάκρυνση της 5’ οδηγού αλληλουχίας από την RNase P. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε μοριακή κλωνοποίηση της La πρωτεΐνης του D. discoideum (354aa, 40,3-kDa) και υπερέκφρασή της. Η ανασυνδυασμένη La-His6 απομονώθηκε σε δύο στάδια καθαρισμού και εξετάστηκε ως προς την ικανότητα δέσμευσής της σε μόρια tRNA με ανάλυση EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay). Τα αποτελέσματα με τη δοκιμή του ομόλογου pre-tRNASer που φέρει 3’ ακόλουθη αλληλουχία ως προσδέτη σε σχέση με ένα pre- tRNASer στο οποίο απουσιάζει η αντίστοιχη αλληλουχία, έδειξε ότι η La πρωτεΐνη έχει προτίμηση για αυτούσια πρόδρομα tRNA. In silico ανάλυση της πρωτεΐνης, έδειξε ότι περιλαμβάνει μοτίβα χαρακτηριστικά για RNA πρόσδεση με υψηλή συντήρηση στο Ν-τελικό της άκρο. Η προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης La αναστέλλει σε ένα ποσοστό 10% την ωρίμανση του tRNA από την ομόλογη RNase P. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκαν in vitro δοκιμές για τη μελέτη της ικανότητας της La να βοηθά στη σωστή αναδίπλωση και άλλων πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα ωρίμανσης παρουσία της La και της RNA υπομονάδας της RNase P. Κάτω από ποικίλες συνθήκες δοκιμής η παρουσία της La δεν ευνόησε την ενεργότητα του ριβοενζύμου. Τέλος, φωσφορυλίωση της La πρωτεΐνης σε συγκεκριμένα αμινοξέα δεν έδειξε ενίσχυση της συγγένειας για το υπόστρωμα. Η La του D. discoideum, μπορεί να συνδέεται με αρκετά μεγάλη συγγένεια με το ομόλογό της υπόστρωμα (Kd = 4±1nM, συγκρίσιμη με αντίστοιχες τιμές ομόλογων πρωτεϊνών) χωρίς την απαίτηση του μοτίβου 3’UUU-OH, το οποίο φαίνεται να είναι απαραίτητο για La πρωτεΐνες από άλλους οργανισμούς (H. sapiens, S. pombe, S. cerevisiae, T. brucei). Το γεγονός αυτό εγείρει πολλά ερωτήματα για την εξελικτική προέλευση αυτής της πρωτεΐνης και για την εξακρίβωση του ρόλου της ως αυτοαντιγόνου στα νοσήματα που αναφέρθηκαν. Βιοχημικές και δομικές μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να απαντήσουν σε αυτά τα ερωτήματα.
Description
Keywords
Πρωτεΐνη La, Βιογένεση μορίων tRNA