Αξιοποίηση της MS/MS λειτουργίας στη μεταβολομική ανάλυση με χρωματογραφία υγρών-φασματομετρία μάζας
Loading...
Date
Authors
Καλτσή, Χαρίκλεια
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η μεταβολομική, μια από τις πιο πρόσφατες ομικές πλατφόρμες, είναι μια υψηλής απόδοσης ανάλυση της φυσιολογίας ενός βιολογικού συστήματος σε μεταβολικό επίπεδο και αφορά στον ταυτόχρονο προσδιορισμό και ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης μεγάλου αριθμού μεταβολιτών μικρού μοριακού βάρους υπό συγκεκριμένες συνθήκες κυτταρικής λειτουργίας το σύνολο των οποίων αντιπροσωπεύουν το μεταβόλωμα. Οι μεταβολίτες είναι μόρια χαμηλού μοριακού βάρους που αποτελούν τα αντιδρώντα και προϊόντα των χημικών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα σε ένα βιολογικό σύστημα, επίσης αποτελούν τα δομικά στοιχεία άλλων βιολογικών μορίων όπως π.χ. των πρωτεϊνών. Το προφίλ των συγκεντρώσεων όλων των (μετρήσιμων) μεταβολιτών αποτελεί το μεταβολικό αποτύπωμα/προφίλ ενός βιολογικού συστήματος για μια δεδομένη στιγμή και κατάσταση. Η οποιαδήποτε αλλαγή των συγκεντρώσεων των μεταβολιτών αντικατοπτρίζει την απόκριση ενός βιολογικού συστήματος τόσο σε περιβαλλοντικές όσο και σε γενετικές αλλαγές, και μας δίνει τη δυνατότητα κατανόησης των φαινοτύπων. Για τον λόγο αυτό είναι αναγκαία η μη στοχευόμενη μεταβολομική ανάλυση που αναφέρεται στην ποσοτικοποίηση όσο το δυνατόν περισσότερων μεταβολιτών ενός βιολογικού συστήματος καθώς και η απόκτηση γνώσης για τις μοριακές δυναμικές και τις ταχύτητες αυτών των αντιδράσεων στο ανακατασκευασμένο εν δυνάμει μεταβολικό δίκτυο. Παρόλ΄αυτά η ανάλυση των μεταβολιτών δεν είναι τόσο ευθύς διαδικασία λόγω της μεγάλης ποικιλότητας που παρουσιάζουν ως προς την χημική δομή. Για την ταυτοποίηση και μέτρηση της συγκέντρωσης των μεταβολιτών οι κύριες αναλυτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι η χρωματογραφία υγρών ή αερίων σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (liquid chromatography – mass spectrometry, LC-MS / Gas chromatography – mass spectrometry, GC-MS) και ο πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (ΝΜR). Στον χρωματογράφο υγρών-φασματόμετρο μάζας χρησιμοποιείται ο ιοντισμός από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (Electron Spray Ionization-ESI) για τον ιονισμό των μεταβολιτών που αναλύονται. Αυτό έχεις ως αποτέλεσμα να προκύπτουν συνήθως μοριακά ιόντα για κάθε ουσία δυσκολεύοντας έτσι την ταυτοποίησή της.
Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής έγινε προσπάθεια να χρησιμοποιηθεί η τεχνολογία της διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (Tandem Mass or MS/MS), που
επιτρέπει την θραυσματοποίηση των μοριακών ιόντων, με σκοπό το φάσμα θραυσμάτων που προκύπτει να διευκολύνει την ταυτοποίηση άγνωστων μεταβολιτών.
Αρχικά χρησιμοποιήθηκε η χρωματογραφία υγρών σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) για να αναλυθούν πρότυπες ουσίες και να ληφθούν φάσματα μάζας που σε συνδυασμό με το χρόνο έκλουσης χαρακτηρίζουν κάθε ουσία. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν βιολογικά δείγματα ώστε να επαληθευτούν τα φάσματα θραυσμάτων των πρότυπων ουσιών σε πραγματικές συνθήκες ανάκτησης μεταβολικών προφίλ. Τέλος ανακτήθηκαν φάσματα θραυσμάτων από μέχρι τότε άγνωστους μεταβολίτες που έχουν βρεθεί σε βιολογικά δείγματα. Τα φάσματα αυτά καθώς και άλλα χαρακτηριστικά των άγνωστων μεταβολιτών χρησιμοποιήθηκαν ώστε να γίνει αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων για ουσίες με αντίστοιχα χαρακτηριστικά, με σκοπό τον προσδιορισμό των άγνωστων μεταβολιτών. Επίσης, για την αναγνώριση των άγνωστων ουσιών εκμεταλλευτήκαμε προϋπάρχουσα γνώση για την συμπεριφορά των συγκεντρώσεων τους σε συνθήκες καταπόνησης που μας επιτρέπει να προβλέψουμε την θέση τους στο μεταβολικό δίκτυο του οργανισμού από όπου προέκυψαν.
Description
Keywords
Μεταβολομική, Χρωματογραφία υγρών, Ταυτοποίηση άγνωστων μεταβολιτών, Διαδοχική φασματομετρία μάζας, Δίδυμη φασματομετρία μάζας