Λειτουργικές γονιδιωματικές προσεγγίσεις για τη μελέτη της μορφογένεσης στη Drosophila melanogaster
Loading...
Date
2013-12-18
Authors
Μουρατίδου, Μαρία
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Τα τελευταία χρόνια πολλές ερευνητικές ομάδες εστίασαν στην ταυτοποίηση
γονιδίων που ενέχονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες και η Δροσόφιλα
αποτέλεσε τον ιδανικό οργανισμό-μοντέλο λόγω της διαθεσιμότητας πολλών
γενετικών εργαλείων. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας της RNA παρεμβολής ευνόησε
ιδιαίτερα την ευρείας κλίμακας γενετική ανάλυση στη Δροσόφιλα. Εκμεταλλευόμενοι
τα διαθέσιμα εργαλεία πραγματοποιήσαμε μία μελέτη σάρωσης βασισμένη σε RNAi
για γονίδια που εμπλέκονται στη μορφογένεση του συστήματος των σωματικών μυών
και του επιθηλίου του φτερού της Drosophila melanogaster. Συνολικά, εξετάσαμε
321 γονίδια με συστημική ή ιστοειδική RNAi σιώπηση στο μεσόδερμα ή με
συνδυασμό και των δύο και ταυτοποιήσαμε 58 γονίδια άγνωστης λειτουργίας τα
οποία χρειάζονται για την ανάπτυξη και ομοιόσταση του εμβρυϊκού/προνυμφικού
μυϊκού συστήματος. Περιέργως, στις μισές σχεδόν περιπτώσεις δεν παρατηρήσαμε
φαινότυπο θνησιμότητας πλήρους διεισδυτικότητας, γεγονός που υποδεικνύει ότι ο
αριθμός των γονιδίων που συμμετέχουν στη συγκεκριμένη διεργασία είναι
μεγαλύτερος από αυτόν που έχει προβλεφθεί με βάσει τα αποτελέσματα μίας ευρείας
κλίμακας μελέτης σάρωσης με RNAi στο μυϊκό σύστημα που ολοκληρώθηκε
πρόσφατα. Επιπλέον, μελετήσαμε 242 γονίδια με ιστοειδική σιώπηση στα επιθήλια
και ταυτοποιήσαμε 32, τα οποία είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα, και 24, τα
οποία είναι αναγκαία για τη μορφοποίηση του ενήλικου φτερού. Από τα γονίδια που
έδωσαν θετικό αποτέλεσμα επιλέξαμε ένα το οποίο είναι απαραίτητο και για τις δύο
διεργασίες, το chd64.
Το chd64 κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη που αποτελείται από μία δομική περιοχή
με ομολογία στις καλπονίνες (CH) και ένα μοτίβο CLIK23 και παρουσιάζει 42% και
43% ταυτότητα με τις τρανσγελίνες 2 και 3 των θηλαστικών αντιστοίχως. Οι
τρανσγελίνες συνιστούν μία οικογένεια πρωτεϊνών που εμφανίζουν υψηλό βαθμό
συντήρησης και συμμετέχουν στο σχηματισμό δεσμίδων και στη σταθεροποίηση των
ινιδίων ακτίνης. Το γονιδίωμα της Δροσόφιλας εμπεριέχει τρεις διαφορετικούς
γενετικούς τόπους: CG4694 ή Mp20, CG14996 ή Chd64 and CG5023, σε πλήρη
αναλογία με τα γονιδιώματα των θηλαστικών. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα μας
έδειξαν ότι από τα γονίδια που κωδικοποιούν τις τρεις τρανσγελίνες της Δροσόφιλας
μόνο το Chd64 είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα και τη σωστή ανάπτυξη των
μυϊκών και επιθηλιακών ιστών. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία του γονιδίου ήταναπαραίτητο: α) να διερευνήσουμε το πρότυπο έκφρασης του και β) να αξιολογήσουμε
τα αποτελέσματα της απώλειας λειτουργίας του σε διαφορετικούς ιστούς. Έτσι,
δημιουργήσαμε διαγονιδιακές μύγες που έφεραν τυχαίες ενθέσεις ενός γενωμικού
τμήματος του γονιδίου συζευγμένου με GFP που επέτρεπε την παρατήρηση του
ενδογενούς προτύπου έκφρασης του γονιδίου σε ζωντανό οργανισμό κατά τη
διάρκεια της ανάπτυξης. Ταυτόχρονα, δημιουργήσαμε ένα αντίσωμα έναντι
ολόκληρης της πρωτεΐνης Chd64. Επιπλέον, προμηθευτήκαμε δύο UAS:chd64IR
στελέχη και πολλά διαφορετικά GAL4 στελέχη με σκοπό να μελετήσουμε την
επίδραση της μειορρύθμισης του chd64 σε διαφορετικούς ιστούς. Τέλος,
δημιουργήσαμε δύο ελλείψεις που απομακρύνουν το chd64. Τα δεδομένα που έχουμε
ως τώρα δείχνουν ότι το chd64 εκφράζεται έντονα στον εμβρυϊκό/προνυμφικό
πεπτικό σωλήνα, στα αιμοκύτταρα, στην τραχεία, στο νευρικό σύστημα, στα
περιτραχειακά κύτταρα Inka, στους εμβρυϊκούς δίσκους, στους σιελογόνους αδένες,
στην επιδερμίδα και στα τενόντια κύτταρα. Επιπλέον, διαπιστώσαμε έκφραση του
γονιδίου στα θυλακοκύτταρα και μισχοειδή κύτταρα των ωοθυλακίων. Σε όλους τους
παραπάνω κυτταρικούς τύπους η πρωτεΐνη συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα και
στην περιφέρεια του κυττάρου. Λεπτομερέστερη ανάλυση των μεγάλων κυττάρων
των σιελογόνων αδένων έδειξε ότι η πρωτεΐνη εντοπίζεται σε μεβρανικές δομές που
αντιστοιχούν στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στο φλοιό του κυττάρου, όπου
συνεντοπίζεται με την ακτίνη. Οι μελέτες απώλειας λειτουργίας έδειξαν ότι έκφραση
του chd64 είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα και τη μορφολογία ή/και
λειτουργικότητα των μαλπιγγιανών σωληναρίων. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι η
αναστολή της ζυγωτικής έκφρασης του γονιδίου οδηγεί σε διόγκωση των
μαλπιγγιανών σωληναρίων και σχετίζεται με τη μη φυσιολογική υποκυτταρική
κατανομή της DE-καδερίνης. Ωστόσο, ο τρόπος δράσης του γονιδίου στην
προαναφερθείσα διαδικασία παραμένει άγνωστος. Η απομάκρυνση της μητρικής
προέλευσης Chd64 πρωτεΐνης και η εκτενέστερη εξέταση της διαδικασίας
καθορισμού και της πολικότητας των κυττάρων που συγκροτούν τα μαλπιγγιανά
σωληνάρια σε αγρίου τύπου και μεταλλαγμένο γενετικό υπόβαθρο με τη χρήση
κατάλληλων μαρτύρων θα μας δώσουν νέες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία
του γονίδιου σε ολόκληρο τον οργανισμό.
Description
Keywords
Δροσόφιλα, Τρανσγελίνες, RNA παρεμβολή, Μελέτη σάρωσης, Μυϊκό σύστημα, Επιθήλιο φτερού, Μαλπιγγιανά σωληνάρια