Παραγωγή και δομική μελέτη της πρωτεΐνης 3Cpro του ιού Coxsackie με στόχο τη δημιουργία αντί-ιικών φαρμάκων (drug design)
Loading...
Date
Authors
Κοσίνας, Χρήστος
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Η παρούσα ερευνητική εργασία αφορά στη έκφραση και δομική μελέτη της πρωτεάσης 3C (3Cpro) του ιού Coxsackie, με στόχο το σχεδιασμό κατάλληλων αντί-ιικών φαρμακευτικών μορίων έναντι της συγκεκριμένης πρωτεΐνης-στόχου.
Ο ιός Coxsackievirus κατατάσσεται στην οικογένεια Picornaviridae, χαρακτηριστικό της οποίας αποτελεί το μικρό μέγεθος του ιικού σωματίου και το μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας ως γενετικό υλικό. Το εν λόγω στέλεχος έχει χαρακτηρισθεί ως αιτία πολυάριθμων τύπων καρδιομυοπαθειών, με σοβαρότερα όλων τα περιστατικά μυοκαρδίτιδας. Η πρωτεάση 3C (3Cpro), το πρωτεολυτικό ένζυμο που μελετάται, παίζει σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής του ιού στο κύτταρο-ξενιστή, λόγω της απενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων, στην οποία συντελεί. Η παρουσία παρόμοιων πρωτεασών στα μέλη της οικογένειας Picornaviridae καθώς και σε άλλα παραδείγματα ιών όπως οι ανθρώπινοι κορωναϊοί (coronaviruses), καθιστούν τη συγκεκριμένη πρωτεάση εξαιρετικό μοριακό στόχο για το σχεδιασμό φαρμάκων ευρέως φάσματος.
Για την έκφραση και απομόνωση της πρωτεάσης 3C χρησιμοποιήθηκαν κλασικές τεχνικές της μοριακής βιολογίας, όπως οι καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων, η ηλεκτροφόρηση και η χρωματογραφία FPLC. Η κρυστάλλωση της 3Cpro πραγματοποιήθηκε τόσο με τη μέθοδο Batch για τη δημιουργία πολυκρυσταλλικού υλικού, όσο και με την μέθοδο vapor diffusion (sitting drop) για τη δημιουργία μονοκρυστάλλων.
Το πολυκρυσταλλικό ίζημα που σχηματίστηκε εκτέθηκε σε ακτίνες Χ, στον ερευνητικό σταθμό MS - X04SA του σύγχροτρον Swiss Light Source και ταυτοποιήθηκε ένα πολύμορφο μονοκλινούς συμμετρίας (space group C2) που είχε παρατηρηθεί και σε προηγούμενες μετρήσεις. Παρατηρήθηκε σημαντική βελτίωση της ποιότητας των δεδομένων περίθλασης (d-space resolution) σε σύγκριση με προηγούμενες μετρήσεις που είχαν πραγματοποιηθεί από μέλη του εργαστηρίου, τόσο στο εργαστηριακό περιθλασίμετρο (Malvern Panalytical X’ Pert PRO), όσο και στο σταθμό ID 22 του ευρωπαϊκού σύγχροτρον (ESRF). Η τεχνική περίθλασης ακτινών Χ από πολυκρυσταλλικό υλικό (X-Ray Powder Diffraction-XRPD) που χρησιμοποιήθηκε, έχει αναδειχθεί τα τελευταία χρόνια σε σημαντικό εργαλείο χαρακτηρισμού πρωτεϊνικών πολυκρυσταλλικών υλικών.
Επιπρόσθετα μέσα από επιλογή κατάλληλων μονοκρυστάλλων πραγματοποιήθηκε προκαταρκτική διαλογή δομικών θραυσμάτων για τη 3Cpro μέσω κρυσταλλογραφίας ακτινών Χ (Crystallographic Fragment Screening-CFS). Για τη διαλογή δομικών θραυσμάτων χρησιμοποιήθηκε η βιβλιοθήκη 96 χημικών μορίων F2X Entry Screen που έχει αναπτύξει η ομάδα κρυσταλλογραφικής μελέτης μακρομορίων του ινστιτούτου Helmholtz στο Βερολίνο. Πραγματοποιήθηκε επώαση των μονοκρυστάλλων με κάθε δομικό θραύσμα και συλλογή κρυσταλλογραφικών δεδομένων σε κρυογονικές συνθήκες, στον πειραματικό σταθμό XRD2 στο σύγχροτρον ELETTRA. Στόχος της διαδικασίας ήταν η επίλυση του δομικού μοντέλου της 3Cpro για την ανίχνευση αλληλεπίδρασης των θραυσμάτων με το συγκεκριμένο μοριακό στόχο. Ο εντοπισμός μορίων από την βιβλιοθήκη που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη, αποτελεί ένα πρώτο βήμα για το σχεδιασμό ενώσεων, οι οποίες μέσα από μια διαδικασία βελτιστοποίησης (lead optimization), μπορούν να αποτελέσουν υποψήφιες φαρμακευτικές ενώσεις έναντι της 3Cpro για την αντιμετώπιση της παθολογίας που προκαλεί ο ιός Coxsackievirus. Η δομική πληροφορία που εξάγεται για χημικά μόρια τα οποία αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη, μπορεί να αξιοποιηθεί για το σχεδιασμό ενώσεων που δύναται να παρουσιάζουν ευρεία δράση έναντι μοριακών στόχων. Η προκαταρκτική εφαρμογή του παραπάνω πρωτοκόλλου για την πρωτεάση 3C, οδήγησε στο δομικό χαρακτηρισμό τεσσάρων συμπλόκων πρωτεΐνης-θραύσματος.
Οι στόχοι αυτής της εργασίας είναι ο σχεδιασμός υποψήφιων φαρμακευτικών μορίων με βάση την δομή καθώς και η διεκπεραίωση επιπρόσθετων πειραμάτων (Crystallographic Fragment Screening-CFS) για την διαλογή μεγάλου αριθμού θραυσμάτων. Παράλληλα, εστιάζουμε στην διαρκή ανάπτυξη και εφαρμογή της τεχνικής περίθλασης ακτινών Χ από πολυκρυσταλλικό υλικό καθώς είναι η πλέον κατάλληλη για το δομικό χαρακτηρισμό πολυμόρφων ενός πιθανού συμπλόκου πρωτεΐνης-αναστολέα σε ένα ευρύ φάσμα κρυσταλλικών συνθηκών.
Description
Keywords
Κρυσταλλογραφία πρωτεϊνών, Σχεδιασμός αντι-ιικών φαρμάκων