Μελέτη των cis-ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων στην ανοδική περιοχή του γονιδίου Coup-TF στον αχινό Paracentrotus lividus
Loading...
Date
Authors
Σταμοπούλου, Ανδριάνα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Το γονίδιο Coup-TF είναι ένα πολύ συντηρημένο γονίδιο σε όλα τα μετάζωα και παίζει σημαντικό ρόλο στην οργανογένεση και νευρογένεση. Πρόσφατα πειράματα μεταλλάξεων που έχουν πραγματοποιηθεί στο εργαστήριο μας αποδεικνύουν την ύπαρξη μια περιοχής 320bp, η οποία βρίσκεται στην ανοδική περιοχή του γονιδίου (μεταξύ -212 και -532) και είναι υπεύθυνη για την ρύθμιση του στο στοματικό εξώδερμα στα όψιμα στάδια της εμβρυογένεσης. Συγκεκριμένα, σε αυτή τη περιοχή βρίσκονται τρία στοιχεία απόκρισης στις θέσεις -453, -432 και -377 τα οποία φαίνεται να είναι απαραίτητα και ικανά να κατευθύνουν τη σωστή ποσοτική και ιστοειδική έκφραση. Έτσι, μετάλλαξη του στοιχείου -453 έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση του PlCoup-TF στο στοματικό εξώδερμα στο στάδιο του πλουτέα, ενώ μετάλλαξη των στοιχείων -432 και -377 προκαλεί εκτοπική έκφρασή του σε επιπλέον εμβρυικές περιοχές. Για το λόγο αυτό ο μεταγραφικός παράγοντας (ή παράγοντες) που προσδένει το στοιχείο -453 δρα ως θετικός ρυθμιστής σε αντίθεση με τους παράγοντες που προσδένουν τα στοιχεία -432 και -377, οι οποίοι φαίνεται να λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές. Πραγματοποιώντας in silico ανάλυση των τριών θέσεων πρόσδεσης, κλωνοποιήθηκαν τα cDNAs των μεταγραφικών παραγόντων PlPea και PlElk (Ets family members, στοιχείο -453), PlIrxA (homeo-domain, στοιχείο -432) και PlOtx (orthodenticle related homeo-domain, στοιχείο -377), θεωρώντας τους ως πιθανούς μεταγραφικούς παράγοντες που προσδένουν τα τρία στοιχεία. Χρησιμοποιώντας πειράματα RT-PCR και in situ υβριδοποίησης μελετήθηκε το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου PlOtx, συγκριτικά με το αντίστοιχο του γονιδίου PlCoup-TF. Eπιπλέον μελετήθηκε ο in vivo ρυθμιστικός ρόλος των παραγόντων PlOtx και PlIrxA, ως προς την έκφραση του PlCoup-TF, σε ενεμένα έμβρυα με morpholino αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (knockdown έμβρυα για τους παράγοντες PlOtx και PlIrxA). Επίσης, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της in vitro πρόσδεσης των συγκεκριμένων παραγόντων στα αντίστοιχα στοιχεία απόκρισης με πειράματα EMSA χρησιμοποιώντας in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών δείχνουν ότι ο PlOtx προσδένει το στοιχείο -377 ειδικά και με μεγάλη συγγένεια. Για την αναγνώριση των ζητούμενων μεταγραφικών παραγόντων, πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία χημικής συγγένειας χρησιμοποιώντας DNA των τριών ρυθμιστικών στοιχείων και εκχύλισμα εμβρυικών πυρηνικών πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες που απομονώθηκαν από κάθε DNA στήλη αντίστοιχα, προσδιορίστηκαν μέσω πρωτεομικής ανάλυσης. Έτσι, για κάθε στοιχείο απόκρισης αναγνωρίστηκε ένας αριθμός πιθανών μεταγραφικών παραγόντων. Ο PlOtx βρέθηκε στο θετικό κλάσμα που απομονώθηκε από την χρωματογραφία με το στοιχείο -377.
Description
Keywords
Μεταγραφικοί παράγοντες, Πρωτεομική