Μελέτη των cis-ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων στην ανοδική περιοχή του γονιδίου Coup-TF στον αχινό Paracentrotus lividus
| dc.contributor.advisor | Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος | |
| dc.contributor.author | Σταμοπούλου, Ανδριάνα | |
| dc.contributor.committee | Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος | |
| dc.contributor.committee | Κατσώρης, Παναγιώτης | |
| dc.contributor.committee | Μίντζας, Αναστάσιος | |
| dc.date.accessioned | 2016-06-08T10:37:17Z | |
| dc.date.available | 2016-06-08T10:37:17Z | |
| dc.date.copyright | 2015-11-19 | |
| dc.degree | Μεταπτυχιακή Εργασία | el |
| dc.description.abstract | Το γονίδιο Coup-TF είναι ένα πολύ συντηρημένο γονίδιο σε όλα τα μετάζωα και παίζει σημαντικό ρόλο στην οργανογένεση και νευρογένεση. Πρόσφατα πειράματα μεταλλάξεων που έχουν πραγματοποιηθεί στο εργαστήριο μας αποδεικνύουν την ύπαρξη μια περιοχής 320bp, η οποία βρίσκεται στην ανοδική περιοχή του γονιδίου (μεταξύ -212 και -532) και είναι υπεύθυνη για την ρύθμιση του στο στοματικό εξώδερμα στα όψιμα στάδια της εμβρυογένεσης. Συγκεκριμένα, σε αυτή τη περιοχή βρίσκονται τρία στοιχεία απόκρισης στις θέσεις -453, -432 και -377 τα οποία φαίνεται να είναι απαραίτητα και ικανά να κατευθύνουν τη σωστή ποσοτική και ιστοειδική έκφραση. Έτσι, μετάλλαξη του στοιχείου -453 έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση του PlCoup-TF στο στοματικό εξώδερμα στο στάδιο του πλουτέα, ενώ μετάλλαξη των στοιχείων -432 και -377 προκαλεί εκτοπική έκφρασή του σε επιπλέον εμβρυικές περιοχές. Για το λόγο αυτό ο μεταγραφικός παράγοντας (ή παράγοντες) που προσδένει το στοιχείο -453 δρα ως θετικός ρυθμιστής σε αντίθεση με τους παράγοντες που προσδένουν τα στοιχεία -432 και -377, οι οποίοι φαίνεται να λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές. Πραγματοποιώντας in silico ανάλυση των τριών θέσεων πρόσδεσης, κλωνοποιήθηκαν τα cDNAs των μεταγραφικών παραγόντων PlPea και PlElk (Ets family members, στοιχείο -453), PlIrxA (homeo-domain, στοιχείο -432) και PlOtx (orthodenticle related homeo-domain, στοιχείο -377), θεωρώντας τους ως πιθανούς μεταγραφικούς παράγοντες που προσδένουν τα τρία στοιχεία. Χρησιμοποιώντας πειράματα RT-PCR και in situ υβριδοποίησης μελετήθηκε το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου PlOtx, συγκριτικά με το αντίστοιχο του γονιδίου PlCoup-TF. Eπιπλέον μελετήθηκε ο in vivo ρυθμιστικός ρόλος των παραγόντων PlOtx και PlIrxA, ως προς την έκφραση του PlCoup-TF, σε ενεμένα έμβρυα με morpholino αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (knockdown έμβρυα για τους παράγοντες PlOtx και PlIrxA). Επίσης, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της in vitro πρόσδεσης των συγκεκριμένων παραγόντων στα αντίστοιχα στοιχεία απόκρισης με πειράματα EMSA χρησιμοποιώντας in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών δείχνουν ότι ο PlOtx προσδένει το στοιχείο -377 ειδικά και με μεγάλη συγγένεια. Για την αναγνώριση των ζητούμενων μεταγραφικών παραγόντων, πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία χημικής συγγένειας χρησιμοποιώντας DNA των τριών ρυθμιστικών στοιχείων και εκχύλισμα εμβρυικών πυρηνικών πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες που απομονώθηκαν από κάθε DNA στήλη αντίστοιχα, προσδιορίστηκαν μέσω πρωτεομικής ανάλυσης. Έτσι, για κάθε στοιχείο απόκρισης αναγνωρίστηκε ένας αριθμός πιθανών μεταγραφικών παραγόντων. Ο PlOtx βρέθηκε στο θετικό κλάσμα που απομονώθηκε από την χρωματογραφία με το στοιχείο -377. | el |
| dc.description.translatedabstract | Coup-TF, a highly conserved gene in all metazoans, plays an important role in organogenesis and neurogenesis. Recent mutagenesis studies from our laboratory indicate that an upstream 320bp module (-212 to -532) is responsible for PlCoup-TF’s late embryonic regulation in the oral ectoderm. Specifically, three response elements within this module, located at positions -453, -432 and -377, seem to be necessary and sufficient for correct quantitative and spatial regulation. Thus, mutation of the -453 element results in reduced oral ectoderm expression at pluteus stage, whereas mutations at -432 and -377 sites result in aberrant expression in additional embryonic territories. Therefore, the transcription factor(s) that binds the -453 element acts as a positive regulator in contrast with the factors that bind to -432 and -377 elements, which act as negative regulators. Following an in silico analysis of the three binding sites, cDNAs for the transcription factors PlElk and PlPea (Ets family members, element -453), PlIrxA (homeo-domain protein, element -432) and PlOtx (orthodenticle related homeo-domain, element -377) were cloned, considering them candidate transcription factors that bind to the three cis-acting elements. Using RT-PCR and in situ hybridization experiments the developmental expression profile of the Otx gene was analyzed in relation to Coup-TF’s expression pattern at all embryonic stages. In vitro translated proteins of the aforementioned transcription factors, were tested by EMSA experiments for their in vitro binding ability to the respective cis-acting elements. The results of these experiments indicate that PlOtx binds to the -377 element specifically and with high affinity. Furthermore, the in vivo regulatory role of PlOtx and PlIrxA in regards to PlCoup-TF expression was studied in morphant (knockdown) embryos, created by microinjection of specific morpholino antisense oligonucleotides in P.lividus eggs. In addition, element specific DNA affinity chromatography, using the three cis-acting elements and embryonic nuclear protein extracts, was employed to isolate specific DNA binding proteins. Proteomic analysis was performed for the identification of the corresponding nuclear factors. Within a number of identified proteins for each element, PlOtx was present in the positive fraction isolated from the -377 DNA affinity column. | el |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10889/9316 | |
| dc.language.iso | gr | el |
| dc.rights | 6 | el |
| dc.subject | Μεταγραφικοί παράγοντες | el |
| dc.subject | Πρωτεομική | el |
| dc.subject.alternative | Transcription factors | el |
| dc.subject.alternative | Proteomics | el |
| dc.subject.alternative | Gene regulatory network | el |
| dc.subject.alternative | Coup-TF | el |
| dc.subject.ddc | 576.54 | el |
| dc.title | Μελέτη των cis-ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων στην ανοδική περιοχή του γονιδίου Coup-TF στον αχινό Paracentrotus lividus | el |
| dc.type | Thesis | el |