Διερεύνηση συσχέτισης τοπολογίας του DNA και οργάνωσης του γονιδιώματος
Loading...
Date
2025-10-21
Authors
Σταυρίδου, Αμαλία-Ιωάννα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Σε όλους τους οργανισμούς, το γενετικό υλικό στο εσωτερικό των κυττάρων τους, δύναται να αποκτήσει ένα μεγάλο εύρος τοπολογιών. Η τοπολογία του DNA, σε μεγάλο βαθμό επηρεάζεται από την υπερελίκωση του DNA γύρω από τον άξονα του, η οποία παρατηρείται είτε αριστερόστροφα (αρνητική υπερελίκωση) είτε δεξιόστροφα (θετική υπερελίκωση). Οι υπερελικώσεις δημιουργούνται από διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου που απαιτούν το άνοιγμα της διπλής έλικας. Συγκεκριμένα η κίνηση και δράση των πολυμερασών που συμμετέχουν στις διεργασίες της μεταγραφής και της αντιγραφής, κατά μήκος της αλυσίδας του DNA, προκαλεί άνοιγμα της έλικας με υπερελικώσεις εκατέρωθεν. Η δημιουργία αυτών των υπερελικώσεων, εισάγει στο γενετικό υλικό μηχανική τάση, η παραμονή της οποίας μπορεί να είναι εμπόδιο για την ολοκλήρωση των διεργασιών προκαλώντας αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και βλάβες στο DNA. Αν και υπάρχουν μεθοδολογίες εντοπισμού αρνητικών υπερελικώσεων στο DNA, ο εντοπισμός θετικών υπερλικώσεων δεν είναι ακόμα δυνατός λόγω της απουσίας τεχνολογιών που μπορούν να το καταφέρουν. Βασικός μηχανισμός ελέγχου και ρύθμισης της υπερελίκωσης του DNA αποτελούν τα ένζυμα τοποϊσομεράσες, τα οποία είναι ικανά να εισάγουν αλλά και να αφαιρέσουν υπερελικωμένα τμήματα DNA. Κρίνεται λοιπόν απαραίτητη η δράση των τοποϊσομερασών για την διατήρηση της ισορροπίας του κυτταρικού κύκλου και τη διατήρηση της γονιδιωματική σταθερότητας.
Οι DNA τοποϊσομεράσες λύνουν μια σειρά από τοπολογικά προβλήματα, δημιουργώντας προσωρινές θραύσεις σε μονές αλλά και διπλές αλυσίδες του DNA. Τα ένζυμα ρυθμίζουν τα επίπεδα των υπερελικώσεων για να υπάρχει δυνατότητα αλληλεπίδρασης ποικιλίας πρωτεϊνών με το DNA και για να αποτραπεί η αρνητική επίδραση που συνοδεύει τα αυξημένα επίπεδα τους. Παρ’ όλη την πρόοδο που έχει γίνει στην κατανόηση της δράσης τους, οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν, το πότε, πού και πώς δρουν, παραμένουν άγνωστοι σε μεγάλο βαθμό.
Η μελέτη των υπερελικώσεων και των τοποϊσομερασών σε βακτήρια έχει συμβάλει στην ανακάλυψη πρωτεϊνών που έχουν προωθητικό ρόλο στην λειτουργία των ενζύμων και συμβάλλουν στην αφαίρεση υπερελικώσεων. Συγκεκριμένα στο βακτήριο Caulobacter crescentus ανακαλύφθηκε η πρωτεΐνη GapR, η οποία αναγνωρίζει και προωθεί την εξάλειψη των θετικών υπερελικώσεων, προωθώντας τη δράση των βακτηριακών τοποϊσομερασών.
Σε πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου μας (Longo et al., 2024), η βακτηριακή πρωτεΐνη GapR, αξιοποιήθηκε για την πρώτη γονιδιωματική χαρτογράφηση θετικών υπερελικώσεων στο ανθρώπινο DNA με τη μεθοδολογία GapRUN, μια παραλλαγή της CUT&RUN. Η GapRUN βασίζεται στη ρυθμιζόμενη έκφραση της GapR-GFP και στη χρήση νανοαντισωμάτων κατά της GFP συντηγμένων με MNase. Αν και η προσέγγιση αυτή επιτρέπει χαρτογράφηση σε όλο το γονιδίωμα, η σταθερή δέσμευση της GapR στη χρωματίνη περιορίζει τη μελέτη δυναμικών αλλαγών στις υπερελικώσεις.
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη βελτιστοποιημένων εργαλείων για την αξιόπιστη και δυναμική χαρτογράφηση των θετικών υπερελικώσεων στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν νέες εκδοχές της κασέτας που περιέχει την πρωτεΐνη GapR, με ρυθμιζόμενο πυρηνικό εντοπισμό και διαφορετικό επίτοπο προς ανίχνευση, ώστε να καταστεί δυνατή η χρονικά ελεγχόμενη μελέτη της κατανομής και των δυναμικών μεταβολών των θετικών υπερελικώσεων μέσω μικροσκοπίας φθορισμού και της μεθοδολογίας GapRUN.
Οι κασέτες αυτές εισήχθησαν σε κυτταρικές σειρές με ενσωματωμένο το σύστημα AID, το οποίο επιτρέπει την ταχεία και στοχευμένη αποδόμηση πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα στις σειρές HCT116 TOP1mAID, HCT116 RAD21mAID, HCT116 TOP2AmAID και HCT116 TOP2AmAID TOP2BKO. Η αξιολόγηση βασίστηκε σε ανοσοφθορισμό, μικροσκοπική παρατήρηση και ποσοτική ανάλυση του σήματος που αντιστοιχούσε στον εντοπισμό της GapR, υπό συνθήκες παρουσίας ή απουσίας των προαναφερθέντων πρωτεϊνών.
Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση των υπερελικώσεων κατά την αποσιώπηση της TOP1, εύρημα που αναπαράχθηκε σε δύο ανεξάρτητες επαναλήψεις. Αντίθετα, η αποσιώπηση της RAD21 δεν φάνηκε να επηρεάζει ουσιαστικά τα επίπεδα υπερελίκωσης. Όσον αφορά τις τοποϊσομεράσες τύπου ΙΙ, σε μία πρώτη πειραματική προσέγγιση παρατηρήθηκε πιο έντονη αύξηση υπερελίκωσης κατά την ταυτόχρονη αποσιώπηση των ισομορφών TOP2A και TOP2B, σε σύγκριση με την αποσιώπηση μόνο της TOP2A ή μόνο της TOP2B, με τη TOP2A να έχει εντονότερη επίδραση από την TOP2B.
Description
Keywords
Οργάνωση γονιδιώματος, Τοποϊσομεράσες, Τοπολογία DNA