Διερεύνηση συσχέτισης τοπολογίας του DNA και οργάνωσης του γονιδιώματος
| datacite.contributor.Supervisor | Ρούκος, Βασίλειος | |
| datacite.contributor.Supervisor | Λυγερού, Ζωή | |
| datacite.contributor.Supervisor | Μικέλης, Κωνσταντίνος | |
| dc.contributor.author | Σταυρίδου, Αμαλία-Ιωάννα | |
| dc.contributor.other | Stavridou, Amalia-Ioanna | |
| dc.date.accessioned | 2025-10-22T05:25:32Z | |
| dc.date.available | 2025-10-22T05:25:32Z | |
| dc.date.issued | 2025-10-21 | |
| dc.degree | masterThesis | |
| dc.description.abstract | Σε όλους τους οργανισμούς, το γενετικό υλικό στο εσωτερικό των κυττάρων τους, δύναται να αποκτήσει ένα μεγάλο εύρος τοπολογιών. Η τοπολογία του DNA, σε μεγάλο βαθμό επηρεάζεται από την υπερελίκωση του DNA γύρω από τον άξονα του, η οποία παρατηρείται είτε αριστερόστροφα (αρνητική υπερελίκωση) είτε δεξιόστροφα (θετική υπερελίκωση). Οι υπερελικώσεις δημιουργούνται από διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου που απαιτούν το άνοιγμα της διπλής έλικας. Συγκεκριμένα η κίνηση και δράση των πολυμερασών που συμμετέχουν στις διεργασίες της μεταγραφής και της αντιγραφής, κατά μήκος της αλυσίδας του DNA, προκαλεί άνοιγμα της έλικας με υπερελικώσεις εκατέρωθεν. Η δημιουργία αυτών των υπερελικώσεων, εισάγει στο γενετικό υλικό μηχανική τάση, η παραμονή της οποίας μπορεί να είναι εμπόδιο για την ολοκλήρωση των διεργασιών προκαλώντας αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και βλάβες στο DNA. Αν και υπάρχουν μεθοδολογίες εντοπισμού αρνητικών υπερελικώσεων στο DNA, ο εντοπισμός θετικών υπερλικώσεων δεν είναι ακόμα δυνατός λόγω της απουσίας τεχνολογιών που μπορούν να το καταφέρουν. Βασικός μηχανισμός ελέγχου και ρύθμισης της υπερελίκωσης του DNA αποτελούν τα ένζυμα τοποϊσομεράσες, τα οποία είναι ικανά να εισάγουν αλλά και να αφαιρέσουν υπερελικωμένα τμήματα DNA. Κρίνεται λοιπόν απαραίτητη η δράση των τοποϊσομερασών για την διατήρηση της ισορροπίας του κυτταρικού κύκλου και τη διατήρηση της γονιδιωματική σταθερότητας. Οι DNA τοποϊσομεράσες λύνουν μια σειρά από τοπολογικά προβλήματα, δημιουργώντας προσωρινές θραύσεις σε μονές αλλά και διπλές αλυσίδες του DNA. Τα ένζυμα ρυθμίζουν τα επίπεδα των υπερελικώσεων για να υπάρχει δυνατότητα αλληλεπίδρασης ποικιλίας πρωτεϊνών με το DNA και για να αποτραπεί η αρνητική επίδραση που συνοδεύει τα αυξημένα επίπεδα τους. Παρ’ όλη την πρόοδο που έχει γίνει στην κατανόηση της δράσης τους, οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν, το πότε, πού και πώς δρουν, παραμένουν άγνωστοι σε μεγάλο βαθμό. Η μελέτη των υπερελικώσεων και των τοποϊσομερασών σε βακτήρια έχει συμβάλει στην ανακάλυψη πρωτεϊνών που έχουν προωθητικό ρόλο στην λειτουργία των ενζύμων και συμβάλλουν στην αφαίρεση υπερελικώσεων. Συγκεκριμένα στο βακτήριο Caulobacter crescentus ανακαλύφθηκε η πρωτεΐνη GapR, η οποία αναγνωρίζει και προωθεί την εξάλειψη των θετικών υπερελικώσεων, προωθώντας τη δράση των βακτηριακών τοποϊσομερασών. Σε πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου μας (Longo et al., 2024), η βακτηριακή πρωτεΐνη GapR, αξιοποιήθηκε για την πρώτη γονιδιωματική χαρτογράφηση θετικών υπερελικώσεων στο ανθρώπινο DNA με τη μεθοδολογία GapRUN, μια παραλλαγή της CUT&RUN. Η GapRUN βασίζεται στη ρυθμιζόμενη έκφραση της GapR-GFP και στη χρήση νανοαντισωμάτων κατά της GFP συντηγμένων με MNase. Αν και η προσέγγιση αυτή επιτρέπει χαρτογράφηση σε όλο το γονιδίωμα, η σταθερή δέσμευση της GapR στη χρωματίνη περιορίζει τη μελέτη δυναμικών αλλαγών στις υπερελικώσεις. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη βελτιστοποιημένων εργαλείων για την αξιόπιστη και δυναμική χαρτογράφηση των θετικών υπερελικώσεων στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν νέες εκδοχές της κασέτας που περιέχει την πρωτεΐνη GapR, με ρυθμιζόμενο πυρηνικό εντοπισμό και διαφορετικό επίτοπο προς ανίχνευση, ώστε να καταστεί δυνατή η χρονικά ελεγχόμενη μελέτη της κατανομής και των δυναμικών μεταβολών των θετικών υπερελικώσεων μέσω μικροσκοπίας φθορισμού και της μεθοδολογίας GapRUN. Οι κασέτες αυτές εισήχθησαν σε κυτταρικές σειρές με ενσωματωμένο το σύστημα AID, το οποίο επιτρέπει την ταχεία και στοχευμένη αποδόμηση πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα στις σειρές HCT116 TOP1mAID, HCT116 RAD21mAID, HCT116 TOP2AmAID και HCT116 TOP2AmAID TOP2BKO. Η αξιολόγηση βασίστηκε σε ανοσοφθορισμό, μικροσκοπική παρατήρηση και ποσοτική ανάλυση του σήματος που αντιστοιχούσε στον εντοπισμό της GapR, υπό συνθήκες παρουσίας ή απουσίας των προαναφερθέντων πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση των υπερελικώσεων κατά την αποσιώπηση της TOP1, εύρημα που αναπαράχθηκε σε δύο ανεξάρτητες επαναλήψεις. Αντίθετα, η αποσιώπηση της RAD21 δεν φάνηκε να επηρεάζει ουσιαστικά τα επίπεδα υπερελίκωσης. Όσον αφορά τις τοποϊσομεράσες τύπου ΙΙ, σε μία πρώτη πειραματική προσέγγιση παρατηρήθηκε πιο έντονη αύξηση υπερελίκωσης κατά την ταυτόχρονη αποσιώπηση των ισομορφών TOP2A και TOP2B, σε σύγκριση με την αποσιώπηση μόνο της TOP2A ή μόνο της TOP2B, με τη TOP2A να έχει εντονότερη επίδραση από την TOP2B. | |
| dc.description.translatedabstract | In all organisms, the genetic material within their cells can acquire a wide range of topologies. DNA topology is largely influenced by supercoiling around its axis, which occurs either left-handed (negative supercoiling) or right-handed (positive supercoiling). While methodologies for detecting negative supercoiling in DNA are available, the detection of positive supercoiling has not yet been achieved due to the absence of suitable technologies. A key mechanism for the control and regulation of DNA supercoiling is carried out by topoisomerases, enzymes capable of both introducing and removing supercoiled DNA segments. Supercoiling is generated by cell cycle processes that require the unwinding of the double helix. Specifically, the movement and activity of polymerases during transcription and replication along the DNA strand induce local unwinding, generating supercoiling ahead of and behind the moving complex. The accumulation of such supercoiling introduces mechanical stress into the genetic material, which, if left unresolved, can hinder these processes, leading to alterations in gene expression and DNA damage. Therefore, the action of topoisomerases is essential for maintaining cell cycle balance and genome stability. DNA topoisomerases resolve a variety of topological problems by creating transient breaks in single or double DNA strands. These enzymes regulate the levels of supercoiling to facilitate interactions between DNA and diverse proteins, while preventing the detrimental effects associated with elevated supercoiling. Despite significant progress in understanding their activity, the molecular mechanisms determining when, where, and how they act remain largely unknown. The study of DNA supercoiling and topoisomerases in bacteria has led to the discovery of proteins that enhance enzyme activity and contribute to the removal of supercoils. In particular, in the bacterium Caulobacter crescentus, the protein GapR was identified as a factor that recognizes and promotes the removal of positive supercoiling, thereby enhancing the activity of bacterial topoisomerases. In a recent study from our laboratory (Longo et al., 2024), the bacterial protein GapR was utilized for the first genome-wide mapping of positive supercoiling in human DNA through GapRUN, a variation of the CUT&RUN methodology. GapRUN relies on the regulated expression of GapR fused to GFP and the mapping of its chromatin binding sites using GFP-targeting nanobodies fused to the MNase endonuclease. Although this approach enables genome-wide mapping, the stable binding of GapR to chromatin limits the investigation of dynamic changes in supercoiling. The aim of the present thesis was the development of optimized tools for reliable and dynamic mapping of positive supercoiling in the human genome. To this end, new versions of the GapR cassette were designed, incorporating regulated nuclear localization and alternative epitope tagging, thereby allowing the temporally controlled study of the distribution and dynamic changes of positive supercoiling through fluorescence microscopy and the GapRUN methodology. These cassettes were introduced into cell lines engineered with the AID system, which allows rapid and targeted protein degradation. Experiments were conducted in HCT116 TOP1mAID, HCT116 RAD21mAID, HCT116 TOP2AmAID, and HCT116 TOP2AmAID TOP2BKO cell lines. Evaluation was based on immunofluorescence, microscopic observation, and quantitative analysis of GapR localization under conditions of protein presence or depletion. The results demonstrated a significant increase in positive supercoiling upon TOP1 depletion, consistently observed across two independent replicates. In contrast, RAD21 depletion did not appear to substantially affect supercoiling levels. Regarding type II topoisomerases, an initial experimental approach revealed a stronger increase in supercoiling when both TOP2A and TOP2B were simultaneously depleted, compared to depletion of either isoform alone, with TOP2A depletion exerting a more pronounced effect than TOP2B. | |
| dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/10889/30810 | |
| dc.language.iso | el | |
| dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Greece | en |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/ | |
| dc.subject | Οργάνωση γονιδιώματος | |
| dc.subject | Τοποϊσομεράσες | |
| dc.subject | Τοπολογία DNA | |
| dc.subject.alternative | Positive supercoiling | |
| dc.subject.alternative | Genome stability | |
| dc.subject.alternative | DNA topology | |
| dc.title | Διερεύνηση συσχέτισης τοπολογίας του DNA και οργάνωσης του γονιδιώματος | |
| dc.title.alternative | Exploring the relationship between DNA topology and genome organization |