Ανάπτυξη, χαρακτηρισμός και μοριακή φαινοτύπηση κυτταρικών κλώνων υπερέκφρασης της πρωτεΐνης του σωματείου συναρμογής FRA10AC1
Loading...
Date
Authors
Ιβάντσικ, Ουλιάνα
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Εισαγωγή: Το FRA10AC1, ένα εξελικτικά συντηρημένο γονίδιο σε όλα τα πολυκύτταρα και σε αρκετά μονοκυτταρικά είδη ευκαρυωτικών, έχει ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο ως υπεύθυνο για την εμφάνιση της εύθραυστης χρωμοσωματικής θέσης FRA10A. Η πρωτεΐνη FRA10AC1 έχει απομονωθεί βιοχημικά ως συστατικό του σωματείου συναρμογής και πρόσφατα δείχθηκε πειραματικά ο ρόλος της στην αναγνώριση εναλλακτικών θέσεων συναρμογής του pre-mRNA στο Chlamydomonas reinhardtii.
Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η συμβολή στη λειτουργική ανάλυση της FRA10AC1, μέσω της εφαρμογής μοριακών τεχνικών και τη χρήση βιοϋπολογιστικών εργαλείων. Στόχος ήταν η ανάπτυξη και ο μοριακός χαρακτηρισμός κλώνων κυττάρων HeLa μόνιμης υπερέκφρασης ενός διαγονιδίου FRA10AC1, ώστε να αξιοποιηθούν στη μελέτη των συνεπειών της υπερέκφρασης στην κυτταρική φυσιολογία. Ως συνεισφορά στην περαιτέρω ανάλυση των κλώνων υπερέκφρασης και τη διαμόρφωση στοχευμένων ερωτημάτων υπό το πρίσμα της συστημικής βιολογίας, κρίθηκε σκόπιμη η διερεύνηση των βιολογικών χαρακτηριστικών της FRA10AC1 στο πλαίσιο του δικτύου άμεσων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της, αξιοποιώντας δεδομένα του λειτουργικού ρόλου των μελών του δικτύου και τα ιστοειδικά μεταγραφικά πρότυπα έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων.
Αποτελέσματα: Από μοναδιαία κύτταρα HeLa διαμολυσμένα σταθερά με το πλήρους μήκους διαγονίδιο FRA10AC1, αναπτύχθηκαν και αναλύθηκαν περισσότεροι από 20 κυτταρικοί κλώνοι. Ο ποιοτικός και ημι-ποσοτικός έλεγχος της υπερέκφρασης της FRA10AC1 πραγματοποιήθηκε σε μεταγραφικό επίπεδο αξιοποιώντας την τεχνολογία RT-PCR και σε πρωτεϊνικό επίπεδο με παρατήρηση σε μικροσκοπία ανοσοφθορισμού και ανοσοαποτύπωση. Τέσσερις κυτταρικοί κλώνοι δείχθηκε ότι πληρούν συνδυαστικά τα κριτήρια υπερέκφρασης του FRA10AC1 σε μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο και προτείνονται για περαιτέρω ανάλυση. Η μελέτη του δικτύου άμεσων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της FRA10AC1 στον άνθρωπο αποκάλυψε 30 πρωτεΐνες-πρώτους γείτονες, ενώ διερεύνηση του δικτύου αλληλεπιδράσεων μεταξύ ορθόλογων πρωτεϊνών σε πρότυπους οργανισμούς, εμπλούτισε το δίκτυο της FRA10AC1 με 4 επιπλέον πιθανές αλληλεπιδράσεις. Οι πρώτοι γείτονες της FRA10AC1 συμμετέχουν σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Οι περισσότερες (16) ανήκουν στο δίκτυο πρωτεϊνών του σωματίου συναρμογής ισχυροποιώντας τα δεδομένα για τη συνεισφορά της FRA10AC1 σε μηχανισμούς επεξεργασίας του mRNA, ενώ ένας μικρός αριθμός πρώτων γειτόνων της συμμετέχει σε μηχανισμούς μεταγραφής, μετάφρασης, ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου και του μεταβολισμού και της οργάνωσης του κυτταροσκελετού, υποδεικνύοντας την ενδεχόμενη εμπλοκή της FRA10AC1 και σε αυτές τις διεργασίες. Με οπτικοποίηση και πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των προτύπων έκφρασης του FRA10AC1 και των γονιδίων που κωδικοποιούν τους πρώτους γείτονες της FRA10AC1 από 51 ιστούς καταχωρημένων στο πρόγραμμα GTEx, ανακατασκευάστηκαν αξιοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης ομικών δεδομένων ΤΜ4/MeV, ιστοειδικά δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων όπου διακρίνεται η σχετική αφθονία και η ειδική ανά ιστό συμμετοχή κάθε πρωτεΐνης στο δίκτυο. Οι όρχεις παρουσιάζουν τη σημαντικότερη διαφοροποίηση, γεγονός που συνάδει και με το ότι σε αυτόν τον ιστό εντοπίζονται τρία επιπλέον εναλλακτικά μετάγραφα του FRA10AC1 με συνεπαγόμενη σημαντική ετερογένεια στην καρβoξυ-τελική περιοχή των αντίστοιχων ισομαρφών FRA10AC1. Το FRA10AC1 παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα ως προς το πρότυπο έκφρασης με το γονίδιο NKAP, που κωδικοποιεί τον ομώνυμο μεταγραφικό παράγοντα, υποδεικνύοντας την ευρύτατη συρρύθμισή τους και την από κοινού συμμετοχή των δύο πρωτεϊνικών προϊόντων σε κυτταρικές λειτουργίες.
Συμπεράσματα: Ικανός αριθμός ανασυνδυασμένων κλώνων κυττάρων HeLa που αναπτύχθηκαν στην παρούσα εργασία πληρούν τις προϋποθέσεις για τη μελέτη του ρόλου της FRA10AC1 στη φυσιολογία του κυττάρου χρησιμοποιώντας συνδυαστικές ομικές αναλύσεις. Ο εμπλουτισμός του δικτύου αλληλεπιδράσεων της FRA10AC1 μέσω της διερεύνησης αλληλεπιδράσεων μεταξύ ορθολόγων πρωτεϊνών εγείρει το ερώτημα της πειραματικής επιβεβαίωσης αυτών των αλληλεπιδράσεων και στον άνθρωπο. Η ανακατασκευή των ιστο-ειδικών πρωτεϊνικών δικτύων της FRA10AC1 και οι ποσοτικές και ποιοτικές διαφοροποιήσεις στα επιμέρους δίκτυα που καταγράφηκαν, υπογραμμίζει την ανάγκη θεώρησης των δικτύων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων υπό το πρίσμα της ιστο-ειδικής γονιδιακής ενεργότητας. Ειδικότερα, η σημαντική διαφοροποίηση που παρατηρείται στον όρχι όσον αφορά τα παρατηρούμενα FRA10AC1 εναλλακτικά μετάγραφα και το αντίστοιχο ιστο-ειδικό πρωτεϊνικό δίκτυο υποδεικνύει έναν ξεχωριστό ρόλο της FRA10AC1 στη λεπτή ρύθμιση που απαιτείται για την παραγωγή και διαφοροποίηση των γαμετών. Τέλος, ενδιαφέρον παρουσιάζει το ευρύτατο κοινό πρότυπο μεταγραφικής ρύθμισης του FRA10AC1 και του NKAP και η πειραματική διερεύνηση του ρόλου της FRA10AC1 στις λειτουργίες που συμμετέχει ο μεταγραφικός παράγοντας NKAP.
Description
Keywords
Εύθραυστη θέση, Σωμάτιο συναρμογής, Δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων