Ανάπτυξη, χαρακτηρισμός και μοριακή φαινοτύπηση κυτταρικών κλώνων υπερέκφρασης της πρωτεΐνης του σωματείου συναρμογής FRA10AC1
| datacite.contributor.Supervisor | Νικόλαος Μοσχονάς | |
| datacite.contributor.Supervisor | Μαρία Κλάπα | |
| datacite.contributor.Supervisor | Θεολογία Σαραφίδου | |
| datacite.rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 | el |
| dc.contributor.author | Ιβάντσικ, Ουλιάνα | |
| dc.contributor.other | Ivantsik, Ulyana | |
| dc.date.accessioned | 2020-12-14T08:31:16Z | |
| dc.date.available | 2020-12-14T08:31:16Z | |
| dc.date.copyright | 2020-07-28 | |
| dc.degree | masterThesis | el |
| dc.description.abstract | Εισαγωγή: Το FRA10AC1, ένα εξελικτικά συντηρημένο γονίδιο σε όλα τα πολυκύτταρα και σε αρκετά μονοκυτταρικά είδη ευκαρυωτικών, έχει ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο ως υπεύθυνο για την εμφάνιση της εύθραυστης χρωμοσωματικής θέσης FRA10A. Η πρωτεΐνη FRA10AC1 έχει απομονωθεί βιοχημικά ως συστατικό του σωματείου συναρμογής και πρόσφατα δείχθηκε πειραματικά ο ρόλος της στην αναγνώριση εναλλακτικών θέσεων συναρμογής του pre-mRNA στο Chlamydomonas reinhardtii. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η συμβολή στη λειτουργική ανάλυση της FRA10AC1, μέσω της εφαρμογής μοριακών τεχνικών και τη χρήση βιοϋπολογιστικών εργαλείων. Στόχος ήταν η ανάπτυξη και ο μοριακός χαρακτηρισμός κλώνων κυττάρων HeLa μόνιμης υπερέκφρασης ενός διαγονιδίου FRA10AC1, ώστε να αξιοποιηθούν στη μελέτη των συνεπειών της υπερέκφρασης στην κυτταρική φυσιολογία. Ως συνεισφορά στην περαιτέρω ανάλυση των κλώνων υπερέκφρασης και τη διαμόρφωση στοχευμένων ερωτημάτων υπό το πρίσμα της συστημικής βιολογίας, κρίθηκε σκόπιμη η διερεύνηση των βιολογικών χαρακτηριστικών της FRA10AC1 στο πλαίσιο του δικτύου άμεσων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της, αξιοποιώντας δεδομένα του λειτουργικού ρόλου των μελών του δικτύου και τα ιστοειδικά μεταγραφικά πρότυπα έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων. Αποτελέσματα: Από μοναδιαία κύτταρα HeLa διαμολυσμένα σταθερά με το πλήρους μήκους διαγονίδιο FRA10AC1, αναπτύχθηκαν και αναλύθηκαν περισσότεροι από 20 κυτταρικοί κλώνοι. Ο ποιοτικός και ημι-ποσοτικός έλεγχος της υπερέκφρασης της FRA10AC1 πραγματοποιήθηκε σε μεταγραφικό επίπεδο αξιοποιώντας την τεχνολογία RT-PCR και σε πρωτεϊνικό επίπεδο με παρατήρηση σε μικροσκοπία ανοσοφθορισμού και ανοσοαποτύπωση. Τέσσερις κυτταρικοί κλώνοι δείχθηκε ότι πληρούν συνδυαστικά τα κριτήρια υπερέκφρασης του FRA10AC1 σε μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο και προτείνονται για περαιτέρω ανάλυση. Η μελέτη του δικτύου άμεσων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της FRA10AC1 στον άνθρωπο αποκάλυψε 30 πρωτεΐνες-πρώτους γείτονες, ενώ διερεύνηση του δικτύου αλληλεπιδράσεων μεταξύ ορθόλογων πρωτεϊνών σε πρότυπους οργανισμούς, εμπλούτισε το δίκτυο της FRA10AC1 με 4 επιπλέον πιθανές αλληλεπιδράσεις. Οι πρώτοι γείτονες της FRA10AC1 συμμετέχουν σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Οι περισσότερες (16) ανήκουν στο δίκτυο πρωτεϊνών του σωματίου συναρμογής ισχυροποιώντας τα δεδομένα για τη συνεισφορά της FRA10AC1 σε μηχανισμούς επεξεργασίας του mRNA, ενώ ένας μικρός αριθμός πρώτων γειτόνων της συμμετέχει σε μηχανισμούς μεταγραφής, μετάφρασης, ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου και του μεταβολισμού και της οργάνωσης του κυτταροσκελετού, υποδεικνύοντας την ενδεχόμενη εμπλοκή της FRA10AC1 και σε αυτές τις διεργασίες. Με οπτικοποίηση και πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση των προτύπων έκφρασης του FRA10AC1 και των γονιδίων που κωδικοποιούν τους πρώτους γείτονες της FRA10AC1 από 51 ιστούς καταχωρημένων στο πρόγραμμα GTEx, ανακατασκευάστηκαν αξιοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης ομικών δεδομένων ΤΜ4/MeV, ιστοειδικά δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων όπου διακρίνεται η σχετική αφθονία και η ειδική ανά ιστό συμμετοχή κάθε πρωτεΐνης στο δίκτυο. Οι όρχεις παρουσιάζουν τη σημαντικότερη διαφοροποίηση, γεγονός που συνάδει και με το ότι σε αυτόν τον ιστό εντοπίζονται τρία επιπλέον εναλλακτικά μετάγραφα του FRA10AC1 με συνεπαγόμενη σημαντική ετερογένεια στην καρβoξυ-τελική περιοχή των αντίστοιχων ισομαρφών FRA10AC1. Το FRA10AC1 παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα ως προς το πρότυπο έκφρασης με το γονίδιο NKAP, που κωδικοποιεί τον ομώνυμο μεταγραφικό παράγοντα, υποδεικνύοντας την ευρύτατη συρρύθμισή τους και την από κοινού συμμετοχή των δύο πρωτεϊνικών προϊόντων σε κυτταρικές λειτουργίες. Συμπεράσματα: Ικανός αριθμός ανασυνδυασμένων κλώνων κυττάρων HeLa που αναπτύχθηκαν στην παρούσα εργασία πληρούν τις προϋποθέσεις για τη μελέτη του ρόλου της FRA10AC1 στη φυσιολογία του κυττάρου χρησιμοποιώντας συνδυαστικές ομικές αναλύσεις. Ο εμπλουτισμός του δικτύου αλληλεπιδράσεων της FRA10AC1 μέσω της διερεύνησης αλληλεπιδράσεων μεταξύ ορθολόγων πρωτεϊνών εγείρει το ερώτημα της πειραματικής επιβεβαίωσης αυτών των αλληλεπιδράσεων και στον άνθρωπο. Η ανακατασκευή των ιστο-ειδικών πρωτεϊνικών δικτύων της FRA10AC1 και οι ποσοτικές και ποιοτικές διαφοροποιήσεις στα επιμέρους δίκτυα που καταγράφηκαν, υπογραμμίζει την ανάγκη θεώρησης των δικτύων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων υπό το πρίσμα της ιστο-ειδικής γονιδιακής ενεργότητας. Ειδικότερα, η σημαντική διαφοροποίηση που παρατηρείται στον όρχι όσον αφορά τα παρατηρούμενα FRA10AC1 εναλλακτικά μετάγραφα και το αντίστοιχο ιστο-ειδικό πρωτεϊνικό δίκτυο υποδεικνύει έναν ξεχωριστό ρόλο της FRA10AC1 στη λεπτή ρύθμιση που απαιτείται για την παραγωγή και διαφοροποίηση των γαμετών. Τέλος, ενδιαφέρον παρουσιάζει το ευρύτατο κοινό πρότυπο μεταγραφικής ρύθμισης του FRA10AC1 και του NKAP και η πειραματική διερεύνηση του ρόλου της FRA10AC1 στις λειτουργίες που συμμετέχει ο μεταγραφικός παράγοντας NKAP. | el |
| dc.description.translatedabstract | Introduction: FRA10AC1, an evolutionarily conserved gene in all multicellular and several monocyte species of eukaryotes, has been identified in human as responsible for the appearance of the fragile chromosomal site FRA10A. The FRA10AC1 protein has been isolated biochemically as a component of the spliceosome and has recently been shown experimentally to play a role in identifying alternative splice sites of pre-mRNAs in Chlamydomonas reinhardtii. Aim: The aim of the present study was to contribute to the functional analysis of FRA10AC1, through the application of molecular techniques and the use of biocomputational tools. The aim was to develop and molecularly characterize HeLa cell clones of permanent overexpression of an FRA10AC1 transgene, to be used in the study of the effects of overexpression on cell physiology. As a contribution to the further analysis of overexpression clones and the formation of targeted questions in the spectrum of systemic biology, it was deemed appropriate to investigate the biological characteristics of FRA10AC1 in the context of its direct protein interaction network using the transcriptional expression patterns of the respective genes. Results: From HeLa cell clones stably transfected with the full-length FRA10AC1 transgene, more than 20 cell clones were grown and analyzed. Qualitative and semi-quantitative control of FRA10AC1 overexpression was performed at the transcriptional level using RT-PCR technology and at the protein level by observation using immunofluorescence microscopy and immunoblotting. Four cell clones were shown to meet the combined FRA10AC1 overexpression criteria at the transcriptional and protein levels and are proposed for further analysis. The study of the FRA10AC1 direct protein interaction network in human revealed 30 first-neighbor proteins, while an investigation of the network of interactions between ortholog proteins in model organisms enriched the FRA10AC1 allele network with 4 additional potential interactions. The first neighbors of FRA10AC1 are involved in various cellular functions. Most of them (16) have been biochemically identified as components of spliceosome amplifying data on the contribution of FRA10AC1 to mRNA processing mechanisms, while a small number of its first neighbors are involved in transcription, translation, regulation of cell cycle and metabolism and organization of cytoskeleton, indicating the possible involvement of FRA10AC1 in these processes as well. By visualization and multivariate statistical analysis of the expression patterns of FRA10AC1 and the genes encoding the first neighbors of FRA10AC1 from 51 tissues registered in the GTEx portal, we reconstructed using TM4 / MeV group data analysis software, protein interaction networks distinguishing the relative abundance and tissue-specific participation of each protein in the network. The testes show the most significant differentiation, which is consistent with the fact that in this tissue are produced three additional alternative transcripts of FRA10AC1 with significant heterogeneity in the carboxy-terminal region of the corresponding FRA10AC1 isoforms. FRA10AC1 bears a significant similarity in expression pattern to the NKAP gene, which encodes the homonymous transcription factor, indicating their extensive co-regulation and the co-involvement of the two protein products in cellular functions. Conclusions: A sufficient number of recombinant HeLa cell clones developed in the present work qualify for the study of the role of FRA10AC1 in cell physiology using combined group assays. The enrichment of the FRA10AC1 interaction network through the investigation of interactions between ortholog proteins raises the question of the experimental confirmation of these interactions in human as well. The reconstruction of the tissue-specific protein networks of FRA10AC1 and the quantitative and qualitative differences in the individual networks recorded, underline the need to consider the networks of protein interactions in the spectrum of tissue-specific gene activity. In particular, the significant differentiation observed in the testis with respect to the observed FRA10AC1 alternative transcripts and the corresponding tissue-specific protein network indicate a distinct role of FRA10AC1 in the fine tuning required for the production and differentiation of gametes. Finally, it is interesting the broad common transcriptional regulatory standard of FRA10AC1 and NKAP and the experimental investigation of the role of FRA10AC1 in the functions of the NKAP transcription factor. | el |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10889/14361 | |
| dc.language.iso | gr | el |
| dc.subject | Εύθραυστη θέση | el |
| dc.subject | Σωμάτιο συναρμογής | el |
| dc.subject | Δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων | el |
| dc.subject.alternative | Fragile site | el |
| dc.subject.alternative | FRA10AC1 | el |
| dc.subject.alternative | Spliceosome | el |
| dc.subject.alternative | Protein interaction network | el |
| dc.title | Ανάπτυξη, χαρακτηρισμός και μοριακή φαινοτύπηση κυτταρικών κλώνων υπερέκφρασης της πρωτεΐνης του σωματείου συναρμογής FRA10AC1 | el |
| dc.title.alternative | Development, characterization and molecular phenotyping of overexpression cell clones of the FRA10AC1 spliceosomal protein | el |
| oaire.licenseCondition | null | el |
Files
License bundle
1 - 1 of 1
No Thumbnail Available
- Name:
- license.txt
- Size:
- 4.53 KB
- Format:
- Item-specific license agreed upon to submission
- Description: