Διερεύνηση της επίδρασης της κροκετίνης στο ένζυμο της καλπαΐνης
Loading...
Date
Authors
Βούκλιζα, Φωτεινή
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Οι καλπαΐνες είναι πρωτεάσες κυστεΐνης με ισχυρή εξάρτηση από το ασβέστιο. Οι δύο κύριες ισομορφές των καλπαϊνών, η καλπαΐνη 1 (ή μ-calpain) και η καλπαΐνη 2 (ή m-calpain), είναι αυτές που εκφράζονται σε όλους τους ιστούς. Η απορρύθμιση του πρωτεολυτικού συστήματος αυτών των πρωτεασών οδηγεί στην εμφάνιση μιας ποικιλίας διαταραχών, μεταξύ των οποίων συγκαταλέγεται και ο οφθαλμικός καταρράκτης. Αυξημένη εισροή ιόντων ασβεστίου στα επιθηλιακά κύτταρα των οφθαλμικών φακών, κατόπιν έκθεσής τους σε οξειδωτικούς παράγοντες, ενεργοποιεί τις πρωτεάσες, κυρίως την καλπαΐνη 2, η οποία κατόπιν αυτού θρυμματίζει και κατακρημνίζει τις κρυσταλλίνες, τις κύριες πρωτεΐνες των φακών, οδηγώντας στη θόλωσή τους και στην εμφάνιση καταρράκτη. Αναστολή της καλπαΐνης 2 επομένως, αναμένεται να καθυστερήσει την καταρρακτογένεση.
Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας σε επίμυες, έχει δειχθεί ότι ο κρόκος, στύλοι του άνθους του φυτού Crocus sativus, εμποδίζει την εμφάνιση καταρράκτη. Ο κρόκος είναι πλούσιος σε κροκίνες, γλυκοζίτες του αποκαροτενοειδούς κροκετίνη (8,8’-διαπο-8,8’-καροτενοϊκό οξύ), οι οποίες μεταβολίζονται στο άγλυκο και στο γλυκουρονίδιό τους στον ανθρώπινο οργανισμό.
Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση της ανασταλτικής δράσης της κροκετίνης στη δράση της καλπαΐνης 2 in vitro. Ο φθορισμομετρικός προσδιορισμός της ικανότητας αναστολής βασίστηκε στην ειδική πέψη του υποστρώματος Suc-Leu-Tyr-AMC από το ένζυμο κατόπιν ενεργοποίησής του με ασβέστιο. Ως θετικό δείγμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας των καλπαϊνών 1 και 2, MDL28170, ενώ η παπαΐνη χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της ειδικότητας της κροκετίνης ως προς την καλπαΐνη 2. Ταυτόχρονα διερευνήθηκε και η επίδραση των ενώσεων, διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος, διμεθυλοκροκετίνη και all-trans ρετινοϊκό οξύ στη δράση της καλπαΐνης 2 και της παπαΐνης. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι η κροκετίνη ανέστειλε τη δράση της καλπαΐνης 2 με τιμή IC50 113,8±2,4 μM. Ο διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος δεν επηρέασε καθόλου την ενεργότητα του ενζύμου, ενώ η διμεθυλοκροκετίνη και το all-trans ρετινοϊκό οξύ προκάλεσαν μια μέτρια αναστολή στη δράση της καλπαΐνης 2. Η κροκετίνη επέφερε αναστολή και στη δράση της παπαΐνης με τιμή IC50 39,00±2,44 μΜ, μικρότερη από την τιμή IC50 για την καλπαΐνη 2, που ωστόσο έχει δειχθεί και σε άλλες περιπτώσεις στη διεθνή βιβλιογραφία, δείχνοντας ότι η κροκετίνη δεν είναι ειδικός αναστολέας της δράσης της καλπαΐνης 2. Η διμεθυλοκροκετίνη και το all-trans ρετινοϊκό οξύ επέφεραν μέτριας κλίμακας αναστολή στη δράση της παπαΐνης, ενώ ο διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος δεν ανέστειλε καθόλου τη δράση του ενζύμου.
Στο δεύτερο κύκλο πειραμάτων, προσπαθήσαμε μέσω χρωματογραφίας HPLC και φασματομετρία μάζας UPLC-MS, να διαπιστώσουμε τη δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ της κροκετίνης και της σουλφυδρυλομάδας της γλουταθειόνης, προσομοιάζοντας την αντίδραση μεταξύ κροκετίνης και καλπαΐνης 2. Ως θετικό δείγμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ο διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος ο οποίος από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι αντιδρά με γλουταθειόνη. Η ανάλυση με χρωματογραφία HPLC και φασματομετρία μάζας UPLC-MS της κάθε αντίδρασης ανέδειξε την ύπαρξη προϊόντων και στις δύο αντιδράσεις.
Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία αποδείξαμε για πρώτη φορά ότι η κροκετίνη δύναται να αναστείλει τη δράση της καλπαΐνης 2 in vitro. Η αναστολή φαίνεται να λαμβάνει χώρα μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης του αναστολέα με την κυστεΐνη του ενεργού κέντρου του ενζύμου, μέσω της δημιουργίας ομοιοπολικού δεσμού. Τα αποτελέσματά μας είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη ειδικών αναστολέων της δράσης των καλπαϊνών με βάση την κροκετίνη, με άμεση εφαρμογή στην πρόληψη και στην καθυστέρηση της εμφάνισης του καταρράκτη.
Description
Keywords
Καλπαΐνη 2, Κροκετίνη, Φθορισμός